动脉粥样硬化进展中TLR4结合并激活Src调控巨噬细胞脂质累积和炎症反应的机制研究

Lipid accumulation and inflammation in macrophage is the major factor that contributes to the progression of atherosclerosis. In the present study, we sought to investigate the molecular mechanism underlying this pathological change. We found that Src phosphorylation and its association with Toll-like receptor (TLR) 4 are increased in human artery atheromatous plaque as compared to normal vessels. In vitro studies showed that OxLDL treatment promoted TLR4 interaction with Src and the activation of Src-dependent signaling pathway, which further enhanced inflammation and lipid accumulation in THP-1 derived macrophage. Thus, this study is aim at demonstrating: 1. the specific binding domain that mediates TLR4-Src association; 2. the effects of blocking the formation of TLR4-Src binding on lipid metabolism and inflammation in macrophage; 3. Inhibition of TLR4-Src formation to attenuate the progression of atherosclerosis in vivo. This study will demonstrate the important roles of Src and TLR4 in the pathogenesis of atherosclerosis, and aid the design of strategies for clinical treatment of atherosclerosis.

动脉粥样硬化斑块发生发展的病理过程中，oxLDL诱导巨噬细胞脂质累积和炎症增加是导致斑块进展的重要病理因素。因此，本研究就将针对这一病理变化的分子机制展开研究，前期研究发现：人冠脉粥样硬化斑块组织中TLR4大量结合并激活Src。而oxLDL诱导巨噬细胞后，Src直接调控脂质累积和炎症反应，并通过TLR4结合和激活Src。这提示oxLDL诱导TLR4结合并激活Src是促进斑块形成的重要机制。因此，本研究将探讨：1.TLR4结合并激活Src特异性结合蛋白结构域；2.特异性阻断TLR4结合Src位点对于细胞脂质代谢和炎症反应的影响；3.动物模型中，特异性阻断TLR4和Src结合对于斑块进展的影响。以期阐明动脉粥样硬化斑块进展中的分子机制，并为将来在体干预治疗动脉粥样硬化斑块提供重要的科学依据和实验基础。

背景：动脉粥样硬化斑块发生发展的病理过程中，oxLDL诱导巨噬细胞脂质累积和炎症增加是导致斑块进展的重要病理因素，因此，本研究就将针对这一病理变化的分子机制展开研究。Src蛋白激酶可参与内皮细胞的炎症反应，诱导巨噬细胞吞脂和迁移，刺激血管平滑肌细胞迁移及增殖，贯穿了动脉粥样硬化形成和发展的整个过程。Src是一类由多种细胞外信号分子激活的受体结合型蛋白酪氨酸激酶。主要研究内容：1）TLR4-Src复合体特异性结合蛋白结构域；2）特异性阻断TLR4-Src复合体对于细胞脂质代谢和炎症反应的影响；3）动物模型中，特异性阻断TLR4-Src复合体对于斑块进展的影响。重要结果及科学意义：1）在人动脉粥样硬化斑块浸润的巨噬细胞内，TLR4表达及Src活化程度显著性升高。而Src蛋白的磷酸化水平，随oxLDL刺激呈剂量及时间依赖性升高，但敲减TLR4表达后，其激活水平显著性抑制。而当敲减Src或抑制其活性时，巨噬细胞内脂质累积水平亦大幅下降，并抑制了CD36表达。oxLDL则引起TLR4与Src相互结合并在共定位于巨噬细胞膜表面。该研究科学意义在于Src的去活化或用化学合成物抑制TLR4/Src复合物，可有效减缓动脉粥样硬化的进展过程。2）在人动脉粥样硬化斑块脂质核心区域的平滑肌细胞中，我们发现TLR4、IL-1β、TNF-α、MCP-1 和 MMP-2表达均有显著增加。而体外oxLDL刺激原代平滑肌细胞后，发现其可诱导TLR4快速升高并呈现剂量及时间依赖性，炎症因子表达分泌也随刺激剂量及时间显著性升高。但当TLR4表达敲除或活性阻断时，oxLDL诱导炎症因子表达升高的效应则显著性削弱。此外，oxLDL仅引起平滑肌细胞中p38及NFκB信号通路激活，而当TLR4敲除或活性阻断时，其激活受到抑制。该研究意义在于揭示了动脉粥样硬化发生发展过程中，TLR4对于平滑肌细胞炎症反应的调控作用，如使用人源抗体抑制TLR4活性可有效拮抗动脉粥样硬化。3）分别克隆并过表达Src各蛋白结构，结果发现其中SH3结构域为TLR4和Src结合特异性蛋白结构。而导入SH3后可有效抑制巨噬细胞中脂质累积及炎症反应，而在体试验结果发现其可有效抑制动脉粥样硬化斑块进展。该研究的科学意义为阐释了TLR4与Src结合的蛋白结构特征，而这一蛋白结构域对动脉粥样硬化发展的影响可对未来临床应用提供重要的理论支持。