枯草芽孢杆菌NCD-2中ywbB下游调控基因及根系分泌物中糖类物质在生物膜形成中的功能分析

Biofilm plays a very important role in soil-borne disease control by using antagonistic bacteria. Previous research in our lab indicated that ywbB gene was the most important gene involved in biofilm formation of Bacillus subtilis strain NCD-2, which showed effective control against cotton rhizoctonia damping off. The ywbB down-regulated and biofilm-related genes from strain NCD-2 will be cloned by DNA microarray technology and will be the target genes in this study. Regulation of ywbB on express of the target genes will be confirmed by using Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR (qRT-PCR). Functions of the target genes on biofilm formation and root colonization will be convinced by comparing the target gene knockout mutants with the NCD-2 wild type. The binding region of YwbB protein to the promoter of target genes will be confirmed by the electrophoretic mobility shift assay. Then, the DNase I footprinting analysis will be used to reveal the DNA sequences protected by YwbB protein. The influences of different carbohydrates from cotton root exudates on the biofilm formation of strain NCD-2 will be analyzed in vivo, and the qRT-PCR technique will be used to detect the expression level of target genes. Based on this study, the molecular mechanism of biofilm formation and root colonization of strain NCD-2 will be clarified, and the influences of root carbohydrates exudates on biofilm formation will be understood. It will be contributed to genetic modification of strain NCD-2 and help to reasonable application of strain NCD-2 for controlling cotton soil-borne disease in the field.

生物膜的形成是生防细菌有效防治作物土传病害的关键因素之一。本实验室发现在影响枯草芽孢杆菌NCD-2菌株生物膜产生的多个基因中，ywbB基因起着最主要的作用。本项目拟采用DNA微阵列技术首先确定受ywbB基因调控并与生物膜形成相关的基因（目的基因），通过荧光定量反转录PCR（qRT-PCR）技术阐明ywbB基因对目的基因表达水平的调控作用；其次通过基因突变和互补，明确目的基因在NCD-2菌株生物膜形成及根际定殖中的功能；然后利用凝胶阻滞和Footprinting技术确定YwbB与目的基因的互作方式和结合位点；最后根据棉花根系分泌物中的糖分种类，研究不同糖分对NCD-2菌株生物膜形成的作用，利用qRT-PCR技术定量分析糖对目的基因表达活性的影响。项目的完成将揭示ywbB基因调控生物膜形成的分子机理和植物根系糖类分泌物对生物膜形成的影响，将为生防细菌的遗传改良及土传病害的科学防治提供理论依据。

枯草芽胞杆菌NCD-2菌株能有效防治作物土传病害，该菌株生物膜形成能力与其根际定殖能力和生防效果相关。前期研究证明，ywbB基因正调控NCD-2菌株生物膜形成和根际定殖能力。本项目重点研究ywbB基因对NCD-2菌株生物膜形成的调控机制以及棉花根系分泌物对NCD-2菌株生物膜形成的影响。通过基因芯片技术比较了NCD-2菌株野生型与ywbB突变子之间差异表达的基因，发现NCD-2菌株中受ywbB调控的基因542个，其中上调基因129个，下调基因413个。进一步分析获知，NCD-2菌株中受ywbB调控并且与生物膜形成相关的基因79个，其中上调基因37个，下调基因42个。通过对其中的comA、spoIIAA、sipW和cotJC基因进行定位突变，证明comA、spoIIAA 和sipW 正调控NCD-2菌株生物膜形成和根际定殖能力。比较了NCD-2菌株野生型和phoR、phoP基因突变子之间在surfactin产生和生物膜形成方面的差异，结果证明phoR/phoP双因子系统正调控NCD-2surfactin产生和生物膜形成。发现NCD-2菌株在不同棉花品种的根际定殖能力不同，并且不同品种的根际定殖能力与其根系分泌物对NCD-2菌株生物膜形成的诱导能力相关。分析了根系分泌物中6种糖分、13种氨基酸对NCD-2菌株生物膜形成能力的影响，结果表明，糖类物质中的葡聚糖，氨基酸中的脯氨酸对NCD-2菌株生物膜形成能力影响最大。对NCD-2菌株进行了gfp标记，分析了NCD-2菌株在棉花根际的定殖特性。结果发现，NCD-2菌株不仅可在棉花根表定殖也可定殖到棉花根内部。在根表定殖时，NCD-2菌株首先在根表有一附着点，然后成堆出现，形成生物膜并沿根系细胞间隙有规律的排列。NCD-2菌株主要定殖在棉花主根的分生区、伸长区和成熟区，而在侧根或根尖部位定殖较差。NCD-2菌株既可以穿过根表进入根组织内部，也可通过伤口进入细胞组织内部。以上研究结果有助于深入明确枯草芽胞杆菌生物膜形成的调控机制，同时为明确NCD-2菌株的生防机制提供科学依据。