USP9Y在雄性不育小鼠中的作用和分子机制的研究

Male reproductive dysfunction that leads to sterility is currently a hot topic in the field of reproduction. Elucidation of the pathogenic and regulatory mechanisms of male infertility and sperm abnormalities will provide the theoretical foundation for male infertility treatment and exploration of new approaches to the treatment. Our previous research results by DNA microarray analysis showed that USP9Y mRNA expression level was increased in the testes of sterile pcd males, in which Agtpbp1 was mutated. Therefore this project aims to analyze the expression of USP9Y in the testes of pcd males at different development stages by immunohistochemistry, Western blot and real-time PCR methods. The interaction and regulation between Agtpbp1 and USP9Y proteins will be studied using immunoprecipitation and Western blot, respectively. The effects on the cell cycle and apoptosis by USP9Y overexpression will be explored further. At the same time we will use GST affinity purification method combined with mass spectrometry to obtain the USP9Y protein interactome. Together with the results by the informatics analysis and further experimental study, elucidation of the USP9Y and its interacting proteins in sperm abnormalities and the molecular mechanisms underlying it will positively provide a solid theoretical foundation for the treatment of human male infertility diseases.

男性生殖功能障碍导致不育的研究是目前生殖领域的研究热点之一。研究男性不育的致病机理，阐明精子发生异常的调控机制，将为男性不育的治疗及探索男性不育治疗新途径奠定理论基础。我们利用基因芯片技术的前期研究结果表明，在Agtpbp1蛋白表达缺失的雄性不育的pcd小鼠精巢中USP9Y mRNA表达水平反而增加，因此本课题利用免疫组化、western blot和荧光定量PCR等技术分析USP9Y在小鼠精巢中的表达，结合免疫共沉淀技术研究Agtpbp1和USP9Y之间的相互作用和调控关系，探讨USP9Y过度表达对细胞周期和凋亡的影响。同时采用GST affinity purification的方法并结合质谱技术，获取USP9Y蛋白相互作用组（interactome）图谱，结合生物信息学资源，阐明USP9Y和其相互作用蛋白在精子发生异常中的分子机制，以期为治疗人类男性不育疾病提供扎实的理论基础

精子发生与调控是一个多基因参与的复杂而精细的过程。其中泛素特异性蛋白酶9y（Usp9y）在精子发生与成熟，雄性不育中可能发挥重要作用，但其在细胞和组织中的具体表达定位以及引起雄性不育的分子机制仍不清楚。本课题首先在分子、细胞、组织水平对Usp9y在雄性小鼠中的表达进行了研究，结果表明Usp9y在小鼠睾丸中特异性表达，且在睾丸间质细胞TM3和精原细胞GC1中表达，其在睾丸中的表达水平在小鼠出生后18天显著升高，提示该基因可能在粗线期精母细胞中表达，对于精子的发生具有重要作用。其次，利用免疫共沉淀方法发现USP9Y的泛素C端水解酶UCH功能结构域可与引起pcd雄性不育小鼠表型的AGTPBP1蛋白的C端相互作用，AGTPBP1蛋白C端含有其羧肽酶功能结构域。该结果提示USP9Y可能是AGTPBP1的一个作用底物，USP9Y与AGTPBP1二者可能共同参与小鼠的精子发生，或在精子发生中具有重要作用。第三，利用单分子基因表达谱分析系统，对pcd小鼠睾丸不同不育时期的NF-κb信号通路的关键因子进行了分析，结果发现Ikbkg和Ikbkb基因表达显著上调，这两个基因是NF-κb活化关键因子IKK的重要组成成分。该研究结果提示NF-κb信号通路很可能在pcd小鼠精子发生障碍中发挥重要作用。第四，筛选并鉴定出USP9Y蛋白在小鼠睾丸中的作用蛋白可能对与揭示USP9Y的功能具有重要意义，因此我们利用免疫沉淀结合质谱鉴定的方法筛选到两个靶蛋白，肌球蛋白MYH-11和肌动蛋白ACTIN，二者可能在精子的成熟与运动中发挥重要作用。进一步研究发现MYH-11在pcd雄性不育小鼠睾丸中低表达，这与其精子发生障碍表型相一致。但二者如何与USP9Y，AGTPBP1蛋白作用，调控NF-κB信号通路，进而引起小鼠精子发生障碍的分子机制还需深入研究。