FAAP在小鼠附睾中的功能和作用的分子机制研究

FAAP (focal adhesion associated protein) is a RNA ligase which is evolutionarily conserved and can ligate the 2',3'-cyclic phosphate and 5' 5'-hydroxyl ends of RNA. It is unknown what its physiological functions are. In our previous study, the expression of FAAP is highest in the epididymis initial segment and controlled by testicular factors. Based on these earlier studies, the aims of this project are: to determine its effect on sperm maturation and epididymal development through constructing FAAP gene knockout mice to delete directly its expression in initial segment; to identify whether FAAP regulates the expression of genes associated with sperm maturation via binding AU-rich element (ARE) of their target mRNA; to explore its role in the unfolded protein response (UPS) through detecting the expression dynamic of X-box binding protein 1 (XBP1) and proteins regulated by XBP1 after FAAP is changed in epididymis cells; to study the molecular mechanism resulting its highest expression in initial segment. To sum up, the function of FAAP will be determined in epididymis after the project is finished.

粘着斑相关蛋白（FAAP）是一个在进化上保守、能够一步连接2'3'-环磷酸基和5'-羟基末端的RNA连接酶，生理功能尚不完全清楚。FAAP基因表达经RNAi下调后，小鼠胎儿期致死，线虫胚后发育缓慢，且雄性生殖系统发育异常；我们前期研究亦发现，FAAP在附睾起始段特异性高表达，并受睾丸因子调节。为了确定FAAP在雄性生殖系统中的功能，本项目拟进一步深入研究FAAP在小鼠附睾中的功能和作用的分子机理、及其在起始段高表达的分子机制。包括制备定向敲除附睾起始段中FAAP基因表达的小鼠，检测其对精子成熟和附睾发育的影响；确定其在附睾中是否通过与ARE相互作用，调节某些含ARE并与精子成熟相关基因mRNA的稳定性；研究附睾细胞中FAAP表达水平改变后，XBP1及其调节的基因表达变化，探索其在UPS中的作用；确定附睾起始段中PEA3对FAAP的表达调节。本项目的完成有助于揭示FAAP在附睾中的生理功能。

FAAP是目前后生动物中唯一已知的RNA连接酶，能完成2′,3′-环磷酸酯和5′-羟基末端的连接。其在tRNA和Xbp1 mRNA剪接中起连接作用，但生理功能尚不清楚。本项目研究结果显示，PEA3 对FAAP基因表达没有直接调节作用，另外，FAAP并没有通过ARE区影响mRNA的稳定性。为深入研究该基因在附睾中的功能，我们采用干细胞囊胚注射方法构建了带LoxP位点的FAAP基因条件敲除鼠，并通过Defb41iCre/wt工具鼠在附睾头将FAAP基因靶向敲除，发现小鼠附睾头靶向敲除FAAP基因后导致雄性不育。敲除鼠从出生后到8周龄附睾发育形态正常，11、13和16周龄附睾形态出现异常；由于小鼠个体差异及敲除效果的不同，精子在附睾的不同部位发生堵塞，其中在输出管和近端附睾头发生精子堵塞造成附睾分区紊乱、起始段高柱状细胞完全消失、睾丸生精上皮变薄；当精子堵塞发生在附睾体或附睾尾时，起始段高柱状上皮变矮或差异不明显。FAAP敲除鼠附睾尾分离的精子数量急剧减少，大量精子聚集，活力下降，90%的精子头尾分离或尾部鞭毛形成发夹结构。敲除雄鼠与野生型雌鼠可以正常交配形成阴道栓，但无后代产生，输卵管内发现老化和异常分裂的卵母细胞，无二细胞胚胎。通过实时定量RT-PCR检测发现，敲除鼠附睾中一些对精子成熟和运动起重要作用的基因表达显著下调，如Xbp1、Grp78、Ros1、Esr1/2、Gpr64、Defb42、Lcn5、Lcn8、Cst8、Gpx5、Cldn10-b、Etv5和Actg2。其中，Xbp1、Ros1，Esr1/2和Gpr64等基因的mRNA剪切体也发生显著改变。Ros1，Esr1/2以及Gpr64敲除鼠雄性不育，FAAP敲除鼠表型与他们非常相似，这些基因敲除鼠附睾中Defb42、Lcn5、Lcn8、Cst8、Gpx5、Cldn10-b和Actg2基因表达也显著下调。由此得出结论：在FAAP敲除鼠中，Xbp1、Gpr64和Esr1/2及其下游基因的下调，影响了附睾上皮细胞的重吸收功能，造成附睾腔微环境的改变，使精子转运受阻；Ros1和Actg2的下调，引起附睾起始段上皮高度的改变，进而影响了精子在附睾的成熟。本项目的结果表明，FAAP可能是调节附睾精子成熟的关键“节点”基因，其通过控制Xbp1、Ros1，Esr1/2和Gpr64基因的剪接，影响精子在附睾中的成熟。