Nestin在小鼠胚胎血管发育中的作用及其分子机制

巢蛋白（Nestin）是神经干细胞的重要标志，还在新生血管等组织中高表达。申请人利用Nestin基因敲除小鼠研究显示纯合子小鼠在胚胎11.5天之前死亡，神经干/祖细胞大量凋亡，但引起胚胎死亡的原因不明。进一步研究发现纯合子胚胎与卵黄囊苍白，血管发育障碍，表现为结构混乱、分支减少，提示Nestin可能参与了胚胎血管的发育。本研究拟在前期基础上，利用该模型研究Nestin在胚胎早期血管发育的作用，重点关注Nestin表达缺失后对血管发生、出芽、血管重塑与网络形成的影响、对血管内皮细胞或周细胞增殖、迁移、凋亡的作用及相关机制；进一步利用纯合子（Nes-/-）胚胎干细胞等体外细胞模型观察Nestin 缺失对血管组成细胞增殖、分化、凋亡的影响。通过以上研究，不仅有助于阐明Nestin在血管发育过程中的作用机制，也为进一步研究Nestin 基因敲除对其它脏器发育的影响奠定基础。

本研究利用Nestin基因敲除小鼠及Nestin-GFP转基因小鼠模型，从Nestin+细胞的血管周细胞起源、Nestin通过调节线粒体的结构与功能、Nestin参与细胞分化、迁移、死亡等角度探究了Nestin在胚胎血管发育中的生物学功能及分子机制，揭示了Nestin+细胞在参与组织干细胞池稳定维持中的作用。.利用Nestin基因敲除小鼠模型首次发现了Nestin-/-小鼠在胚胎10.5天左右死亡，且主要由于卵黄囊血管发育障碍引起。卵黄囊的Whole-mount染色发现Nestin-/-小鼠E10.5天血管分支减少，结构紊乱，死亡的细胞全部为血管周细胞。.利用Nestin-GFP转基因小鼠进一步证实了Nestin阳性细胞多分布在血管周围。分离肾脏、睾丸等组织Nestin-GFP阳性细胞，证实该细胞具有自我更新与多向分化潜能，并可修复病损组织。上述研究证实位于血管周的Nestin阳性细胞具有干细胞的特征，在成体组织的稳定维持与再生修复中可能扮演了重要角色。.利用胚胎干细胞（mES）体外诱导血管分化模型，发现 Nestin缺失导致胚胎体中pericyte大量死亡，其主要原因是分化过程中线粒体来源的ROS升高介导的程序性坏死。利用体外细胞模型免疫荧光染色显示线粒体与Nestin共定位。干扰Nestin表达能使线粒体从点状向管状变化，并影响线粒体代谢、产能等生理功能。利用质谱结合Co-IP，免疫荧光染色等方法证实Nestin与线粒体分裂蛋白Drp1结合。下调Nestin表达导致Drp1更多的弥散到胞浆中。首次阐明Nestin通过募集线粒体动力蛋白Drp1影响线粒体形态与功能改变。此外，本研究还发现Nestin不仅可以进入细胞核，通过调节核骨架蛋白LaminA/C的稳定影响了细胞衰老，还可以与内质网、溶酶体等细胞器直接作用在细胞稳态维持与应激应答中发挥作用。综上，Nestin对于血管发育至关重要，血管周Nestin+细胞具有干细胞特性，在组织器官发育与稳定维持中扮演了重要角色。Nestin作为细胞骨架，可能作为一种“支架”影响细胞器结构与功能、改变核骨架稳定在细胞增殖、迁移、分化、坏死等方面扮演了重要角色。