CCP1在小鼠精子发育中的作用机制研究

Ccp1, the new member of the metal carboxypeptidase, can specific remove C-terminal poly glutamic acid or other acidic amino acids from α or β-tubulin and play an important role in the Purkinje cells degeneration. Our previous study found that CCP1 also had an important role in spermatogenesis. This project intends to further study CCP1 metallocarboxypeptidase function and mechanism in spermatogenesis. First of all, we intend to observe the expression of key proteins in MAPK and NF-kappa B signaling pathway in pcd mouse testis to investigate whether CCP1 regulates spermatogenic cell apoptosis through MAPK or NF- kappa B signaling pathway, therefore to find out an effective pathway for study the CCP1 gene function and mechanism in germ cell death. Secondly, to find out the interacting partners or specific substrates of CCP1 protein in mouse testis by protein precipitation combined with LC-MS/MS method. Finally we are going to establish in vitro culture system of spermatogenic cells, and use lentiviral mediated gene silencing methods to analyze the function of CCP1 and its interacting proteins. In conclusion, we carry out a comprehensive study on the role and molecular mechanism of CCP1 in spermatogenic cells, in order to understand the abnormal spermatogenesis in male infertility, to provide theoretical basis for male sterility.

CCP1作为金属羧肽酶的一个新成员，可以特异性对a-或B-tubulin蛋白的C末端多聚谷氨酸或其他酸性氨基酸进行切除，在浦肯野细胞退化中起重要作用。我们前期研究发现CCP1羧肽酶对精子发生具有重要的作用。本课题拟进一步研究CCP1金属羧肽酶在精子发生过程中的作用和机制，观察在pcd小鼠睾丸中MAPK和NF-кB信号通路关键蛋白的表达与活化，探讨 CCP1是否通过 MAPK或NF-кB信号转导通路调控生精细胞的凋亡，为深入研究基因功能与作用机制寻找有效途径；利用免疫沉淀结合LC-MS/MS方法对CCP1蛋白在小鼠睾丸中的相互作用蛋白进行筛选，以期发现睾丸组织中CCP1的作用蛋白或其特异性作用底物；通过建立生精细胞体外培养体系，利用慢病毒介导的基因沉默等方法对CCP1及其相互作用蛋白功能进行分析，对生精细胞中CCP1的作用和分子机制进行全面研究，为了解精子发生异常和雄性不育提供理论基础。

CCP1突变可以引起雄性不育，但作用机制仍不是很清楚。研究发现CCP1突变的pcd小鼠睾丸生精细胞的凋亡可能与NF-кB信号通路和Erk1/2的激活均有关系，NF-кB信号通路在小鼠睾丸生精细胞退化初期起主要作用。利用LC-MS/MS发现324个可能与CCP1相互作用的蛋白，CCP1的突变或敲减可以导致ACTINB、HSPA9、HSPA2、CCT4和SPTAN1核心蛋白的表达下调。进一步分析发现TUBB4B的表达随CCP1的突变而下调，Co-IP实验和免疫荧光检测发现CCP1与TUBB4B相互作用且共定位于细胞质中。CCP1基因在小鼠睾丸的不同发育阶段中均表达。TUBB4B在脑和睾丸中高表达，且在睾丸中广泛表达。通过组织免疫荧光染色对CCP1基因在小鼠精子中的表达进行定位，结果显示CCP1在小鼠精子尾部中段表达。该部分主要为线粒体鞘的轴丝结构，对于精子的运动具有重要作用。TUBB4B在小鼠精子中的表达，与CCP1的表达一致。在CCP1功能缺失的pcd 小鼠睾丸组织中微管蛋白的polyE水平明显升高；在CCP1敲减的GC-1和GC-2细胞中微管蛋白的polyE水平也明显升高。CCP1过表达后的293T细胞中Tubb4b 表达升高，PolyE 表达降低。利用RNAi技术，我们在体外构建了CCP1表达敲减的GC-1和GC-2细胞，并对其生物学功能进行了分析。结果发现CCP1的功能缺失抑制GC1精原细胞增殖，NF-κB和MAPK信号通路的p-ERK1/2和p-p65蛋白表达降低。而在CCP1敲减的GC-2精母细胞中ERK1/2信号通路受到抑制而p38 激活。CCP1表达抑制后，GC1细胞阻滞在 G1/S 期，而GC-2细胞阻滞在 G2/M 期，细胞周期蛋白CCND1 and CCNB1 表达水平也随之降低。通过蛋白质组学分析发现，CCP1表达沉默后的GC-1细胞中差异表达蛋白参与核糖体和代谢途径，与type O聚糖生物合成途径密切相关；CCP1表达沉默后的GC-2细胞中差异表达蛋白参与了蛋白质的消化和吸收途径，焦点粘连，P13K-Akt 和FoxO 信号通路。我们的研究探讨了CCP1在精子发生调控中的潜在的细胞和分子机制，为男性不育的分子诊断和靶向治疗提供一定的理论线索。