骨关节炎靶向非病毒基因转染体系的建立及对软骨细胞和滑膜细胞基因导入的分子机制研究

Our previous study proved that gene control released chitosan(CS)/DNA nanoparticles loaded with IL-1Ra and TGF-β1 gene could reduce the damage in the osteoarthritic cartilage matrix and promote cartilage repair; however, it failed to effectively impede the further deterioration of osteoarthritis. The reason is mainly due to the poor gene transfection efficiency and targeting of chitosan as a non-viral vector, which make it difficult to efficiently deliver the target gene into chondrocytes and synoviocytes. Hyaluronic acid (HA) was then used to modify CS/DNA nanoparticles. Through HA-CD44 interaction, the transfection efficiency against chondrocytes had been greatly improved; but still did not achieve satisfactory effects as we expected. Further studies have shown that the transfection efficiency was highly improved without any cytotoxicity after chitosan backbone covalently linked with small molecules polyethylenimine (PEI), for PEI's "proton sponge effect". This project intends to prepare a HA modified CS-g-PEI(CP) as an efficient non-viral gene vector targeting osteoarthritis, investigate its gene transfection efficiency and affected factors against chondrocytes and synoviocytes in vitro; and its mediated gene transfection molecular mechanism; then further study its clinical effects in the prevention and treatment of early osteoarthritis, so as to provide a safe and effective novel gene control released medicine targeting early osteoarthritis.

我们研究证明了负载IL-1Ra和TGF-β1基因的缓释型壳聚糖（CS）/DNA可减轻骨关节炎软骨基质破坏、促进软骨修复，但仍未能有效阻止骨关节炎的进展。究其原因，主要是由于CS介导的基因转染效率低下，靶向性差，难以高效地将目的基因导入软骨细胞与滑膜细胞。采用透明质酸（HA）修饰CS/DNA，通过HA-CD44相互作用，使对软骨细胞的转染率有了大幅提高，但仍未达到满意效果。进一步研究显示，将小分子量聚乙烯亚胺（PEI）共价连接于CS骨架后可利用PEI的"质子海绵效应"，明显提高转染效率而无明显细胞毒性。本项目拟构建HA修饰的CS-g-PEI(CP)/DNA作为高效的靶向非病毒基因载体，探讨其对关节软骨细胞和滑膜细胞的基因转染率的变化及影响因素，及其介导基因转染的分子机制，并进一步探讨其对骨关节炎的防治作用，旨在为骨关节炎的早期治疗提供安全有效的新型靶向基因缓释药物。

我们研究证实基因缓释型壳聚糖(CS)/DNA可减轻骨关节炎软骨基质破坏、促进软骨修复，但仍未能有效阻止骨关节炎的进展。究其原因， 主要是由于 CS 介导的基因转染效率低下，靶向性差，难以高效地将目的基因导入软骨细胞 与滑膜细胞。通过将小分子量聚乙烯亚胺(PEI 共价连接于 CS 骨架后可利用 PEI 的“质子海绵效应”，明显提高转染效率而无明显细胞毒性，本项目构建透明质酸(HA)修饰的 CS-g-PEI(CP)/DNA，发现HA-CP/pDNA 纳米粒对软骨细胞转染率较 CP/pDNA、CS/pDNA 纳米粒大幅提高(P<0.05)，而大量游离 HA 可竞争 HA-CP/pDNA 纳米粒对软骨细胞 CD44 等受体的结合，导致对软骨细胞的转染效率下降，在激光共聚焦显微下可观察到纳米粒入胞、溶酶体逃逸及进入细胞核实现目的基因的转染，发现壳聚糖携载的DNA能很快进入细胞内，但入核困难；高分子质量PEI能快速从内涵体逃逸并入核，但逃逸过快，内涵体短时间大量破裂影响细胞的生存状态而对细胞产生大的毒性。HA-CP/pDNA携载的DNA在1 h大部分入胞聚集在细胞核周围，2 h后开始已经有部分进入细胞核，说明PEI的质子海绵效应在逃逸能力及入核时间上起着关键的作用。HA-CP/pDNA能够在适当的时间逃逸内涵体，并入核表达，显示其作为非病毒基因载体相对于壳聚糖或PEI的优越性，HA-CP/pDNA 纳米粒可作为高效的骨关节炎靶向非病毒基因载体。在项目研究中同时合成了新型非病毒基因载体-多肽修饰壳聚糖（CS-HK），探讨了该新型基因载体的理化性质及体外细胞转染效率及分子机制，体外细胞转染结果表明，在PH为6.5左右，CS-HK/pDNA（w:w=6:1）纳米粒的转染效率最高，与脂质体的转染效率无明显差异，较PEI/pDNA、CS/pDNA纳米粒转染率高。进一步的动物实验探讨载IL-1Ra等目的基因的HA-CP/pDNA 纳米粒对骨关节炎动物模型的防治作用，发现与体外转染不同，要促使壳聚糖/DNA纳米粒穿透软骨基质再转染软骨细胞较为困难，转染关节滑膜组织的可能性大，其对骨关节炎的防治作用仍有待进一步观察。