泛素系统调控KLF10介导TGF-β1/Smads活性平衡在骨关节炎中的作用及分子机制研究

It has shown that TGF-β1/Smads signaling pathway mediated osteoarthritic(OA) progression. However, the TGF-β1/Smads activity is not consistent in OA joint. We found that low KLF10 regulated expression of Smad7 which mediated TGF-β1/Smads inhibitory in articular cartilage tissue resulting in abnormal articular cartilage matrix synthesis; however, in the subchondral bone, high levels of KLF10 directly inhibit the expression of Smad7 mediated active of TGF-β1/Smads pathway, leading to the formation of osteophytes; furthermore, we confirmed that in OA joint, the differences of KLF10 were regulated by the ubiquitin system. Thus, we propose that the regulation of the ubiquitin system for KLF10 mediates TGF-β1/Smads activity in articular cartilage and subchondral bone leads to the development of OA. This study will complete clinical specimens detection, establish OA animal model, use lentiviral overexpression or interference, apply gene deletions and co-immunoprecipitation techniques to investigate the molecular mechanisms of the ubiquitin system regulate KLF10 which mediates TGF-β1/Smads activity, and to clarify the role of this signaling pathway in OA pathological procession. Which was designed to provide new ideas and experimental evidences for blocking or even reversing the pathological procession of OA.

TGF-β1/Smads信号通路介导了骨关节炎(OA)发生发展，但在OA关节中TGF-β1/Smads活性并非一致。我们发现：低水平KLF10上调Smad7的表达介导关节软骨组织中TGF-β1/Smads活性抑制，导致软骨基质合成异常；而在软骨下骨，高水平的KLF10直接抑制Smad7 的表达介导了TGF-β1/Smads 通路的激活，导致骨赘形成。且我们证实在OA关节中，KLF10差异由泛素系统调控。由此，我们提出：泛素系统调控KLF10介导TGF-β1/Smads活性在关节软骨及软骨下骨中的平衡失调导致OA的发生发展。本项目将进一步完善临床标本检测、构建OA动物模型、采取慢病毒过表达或干扰、缺失突变、免疫共沉淀等技术，探讨泛素系统调控KLF10介导TGF-β1/Smads活性平衡的分子机制，阐明这一信号通路在OA病理进程中的作用，旨在为阻断甚或逆转OA的病理进程提供新的思路和实验依据。

我们研究发现Klupple样因子10 (KLF10)在骨关节炎(OA)患者及小鼠OA模型的软骨组织中均表达上调；在IL-1β刺激的软骨细胞中KLF10的表达也上调。KLF10的过表达抑制了软骨细胞的增殖和迁移。RNA测序显示KLF10过表达软骨细胞中Acvr1基因表达增加和Inhbb基因表达减少。qRT-PCR进一步证实Acvr1和Inhbb的mRNA表达发生了变化。由此揭示KLF10可能通过调节OA中Acvr1和Inhbb的表达抑制软骨细胞的增殖和迁移。进一步，在人软骨细胞抑制KLF10表达，促进软骨细胞合成细胞外基质并抑制IL-1β、IL-6等炎症因子的表达。在H2O2诱导的衰老软骨细胞模型中，KLF10表达上调；抑制KLF10表达可以显著减少衰老调控因子p21及p53的表达，并促进II型胶原及蛋白多糖的合成，抑制MMP13、IL-1β、IL-6等炎症因子的表达；流式细胞检测显示敲除KLF10还可增加软骨细胞中G2和S期的细胞比例。表明KLF10通过调控软骨细胞的细胞周期参与细胞衰老，从而导致细胞外基质的合成和降解失衡，进而调控OA的发展。另外，经TGF-β1刺激下软骨细胞的增殖和迁移明显增强，MMP13的表达降低，而II型胶原表达升高。补充TGF-β1后circPHF21A的水平降低，对circPHF21A的抑制作用与补充TGF-β1相似，通过进一步研究mRNA的表达谱，显示Vegfa和Irs1可以直接或间接成为circPHF21A的靶标。Vegfa水平的降低诱导软骨细胞增殖和迁移的增强，同时COL2A1的蛋白水平升高及MMP13降低，而Irs1的抑制与Vegfa的抑制作用相反。以上结果揭示KLF10可能是OA的潜在治疗靶标，而TGF-β1在OA的进展中起重要作用，circPHF21A-VEGFA-IRS1调节轴可能是TGF-β1调控OA病理进展的主要通路。