靶向血小板膜糖蛋白GPIbα抑制肿瘤转移的作用与分子机制研究

Tumor metastasis to distant organs depends on interactions between tumor cells and the host microenvironment within the circulation. Platelets play a supportive role in tumor metastasis. The platelet-specific receptor glycoprotein (GP) Ibα is a major molecule inducing the accumulation of platelets and tumor cells and contributing to tumor metastasis, but the underlying molecular mechanism remains elusive. In our study, we will establish the screening model to select the anti-GPIbα monoclonal antibody that inhibits tumor metastasis, and examine the effect of this anti-GPIbα monoclonal antibody in syngeneic mouse models of experimental metastasis, and each of the following interactions: between activated platelets and tumor cells, platelets and endothelial cells. Furthermore, epitope peptide will be recognized by detect the binding of antibody in GPIbα mutant cell lines. Coinjection of epitope peptide will be used to confirm anti-metastatic activity of this anti-GPIbα monoclonal antibody in the B16 melanoma model. Final, The crystal structure of Fab/epitope peptide complex may facilitate the development of future specific inhibitors by targeting GPIbα. Our study will demonstrate the mechanism of targeting GPIbα on tumor metastasis.

原发性肿瘤微环境对于肿瘤细胞生长及转移的过程具有决定性作用。其中,血小板与肿瘤细胞间的相互作用为肿瘤细胞的转移提供了条件。近来证实GPIbα是引起血小板-肿瘤细胞聚集的重要分子之一，推测靶向GPIbα有望于肿瘤的转移控制。为此，本研究拟首先建立作为肿瘤转移抑制剂的抗GPIbα单克隆抗体的筛选模型，其次通过肺癌模型验证靶向GPIbα对肿瘤转移的抑制作用，随后检测其对血小板或肿瘤细胞与内皮细胞黏附的影响，明确靶向GPIbα抑制肿瘤转移的调控作用，最后借助GPIbα突变株寻找该抑制剂的结合位点，并观察共同注射抗原表位肽对该抑制剂介导肿瘤转移抑制的逆转作用，探讨靶向GPIbα治疗肿瘤转移的机制，通过共结晶抗原结合片段和抗原表位肽复合物，为设计和改造该抑制剂以及其它由此衍生的抗体以得到更高亲和力和更高特异性的抗体提供了理论基础。本研究为阐明靶向GPIbα抗肿瘤转移的作用，机制与应用价值提供实验依据。

血小板表面的重要膜受体糖蛋白（Glycoprotein，GP）Ib-IX-V可以与进入血液的肿瘤细胞相互作用，从而在肿瘤细胞的血行转移中发挥重要作用。其中GPIbα为GPIb-IX-V复合物中分子量最大也是最重要的部分。然而GPIbα参与肿瘤转移的具体机制尚不明确。除此之外，抑制血小板功能而出现的潜在出血并发症也是抗血小板治疗应用于肿瘤治疗中的极大障碍。本课题利用动物免疫和杂交瘤技术获得杂交瘤细胞克隆，细胞克隆首先通过酶联免疫吸附实验法（ELISA）筛选获得靶向GPIbα的阳性克隆，其次利用血小板-肿瘤细胞粘附实验筛选获得具有抑制功能的阳性克隆，最后，在静息状态下，利用流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)筛选出对血小板活化没有影响的阳性克隆。通过筛选模型的筛选，最终获得大鼠抗小鼠GPIbα单克隆抗体1D12，2B4，以及小鼠抗人GPIbα单克隆抗体YQ3。将抗体纯化后，首先为了检测抗体对肿瘤转移的抑制作用，我们在体外实验中检测了1D12，2B4及YQ3对血小板-肿瘤细胞-内皮细胞之间相互粘附的影响，同时建立了小鼠体内实验性和自发性肺转移模型，进一步通过体内实验证明抗体的抗肿瘤转移能力，实验结果显示，抗体在体内和体外实验中均表现出较高的抑制肿瘤转移的潜能。随后在体内外实验中验证了抗体是否会诱导血小板减少症的发生。实验结果表明，抗体的Fab对血小板正常凝血止血功能以及小鼠体内血小板数量不存在明显影响，不会引起小鼠的血小板减少症。最后为了检测抗体调控肿瘤转移的分子机制吗，纯化后的抗体经ELISA检测确定其具体结合位点，结果显示，抗体与vWF对GPIbα 存在竞争性结合。随后，利用FCM检测发现抗体在体外明显抑制vWF与血小板的结合，阐明了抗体抑制肿瘤转移的机制。本项目系统建立靶向血小板膜糖蛋白GPIbα肿瘤转移抑制剂筛选模型，通过发现靶向血小板GPIbα抑制肿瘤转移但不影响血小板正常止血凝血功能的新型抗体，证明了GPIbα促进肿瘤转移的作用，同时也为抗血小板治疗在肿瘤治疗方面的临床应用提供了可能。