血小板膜蛋白GPIbβ胞内段调控GPIbα酶切的分子机制及其在动脉血栓中作用的研究

Platelet activation is the main cause of arterial thrombotic diseases. GPIbα shedding inhibits platelet activation and plays a role in arterial thrombosis. However, the regulation mechanism of GPIbα shedding is not clear. The results from our previous experiments showed that the membrane-proximal region of the GPIbβ cytoplasmic domain inhibits shedding of GPIbα. It is speculated that the membrane-proximal region of the GPIbβ cytoplasmic domain regulates platelet activation and thrombosis by adjusting the GPIbα shedding. In our previous experiment, some proteins interacting with the membrane-proximal region of the GPIbβ cytoplasmic domain were screened out using pull-down in combination with MS method, including moesin and thrombospondin, but the specific mechanism of interaction of these proteins is unclear. In this study, we will validate the proteins interacting with the membrane-proximal region of the GPIbβ cytoplasmic domain; using fluorescent confocal microscopy to determine intracellular localization of these proteins; then test the regulation of GPIbα shedding by the interest protein; according to the key sequence, we prepare specific GPIbα shedding agonist, and then to test agonist inducing platelet activation in vitro and in vivo thrombus formation in mice, in order to clarify the role of the membrane-proximal region of the GPIbβ cytoplasmic domain in thrombosis. Completion of this work will enrich the theoretical molecular mechanisms of platelet activation and provide a theoretical basis for the development of new antithrombotic drug.

血小板活化是导致动脉血栓性疾病形成的主要原因，GPIbα发生胞外酶切后抑制血小板激活，对动脉血栓形成有重要影响，但调控GPIbα酶切的机制尚不明确。我们在国际上首次发现GPIbβ胞内近膜端可抑制GPIbα酶切，因此推测GPIbβ胞内近膜端通过调节GPIbα酶切以调控血小板活化和血栓形成。我们前期已通过pull-down结合质谱筛选出与GPIbβ胞内近膜端可能相互作用的蛋白，包括moesin和血小板反应蛋白等，但其作用和具体机制有待阐明。本研究将在此基础上明确与GPIbβ胞内段相互作用蛋白并确定蛋白的胞内定位，检测目的蛋白对GPIbα酶切的调控作用及机制；再根据确定的关键序列制备GPIbα酶切特异性刺激剂，检测该刺激剂对体外血小板活化及小鼠体内血栓形成的影响，从而阐明GPIbβ胞内近膜端在动脉血栓形成中的作用。本研究的顺利实施将丰富血小板活化的分子机制理论，并为研发新型抗栓药物提供理论依据。

血小板是动脉血栓形成过程的主要效应细胞，及时有效控制血小板活化是预防动脉血栓形成的主要方法之一。GPIbα 酶切在血栓形成过程中起着负调控的作用。在我们的前期研究中发现GPIbβ胞内近膜端对GPIbα酶切具有抑制作用，胞内尚有除了CaM外的另一种蛋白与GPIbβ胞内段相互作用，调控GPIbα酶切。因此我们为这一未能明确的蛋白及其在调控GPIbα酶切、血小板活化及血栓形成中的作用进行了进一步研究。我们通过pull-down结合质谱结果筛选出与GPIbβ胞内近膜端可能结合的蛋白，并通过co-IP和细胞内共定位初步明确了与GPIbβ胞内近膜端结合的蛋白是moesin。 co-IP结果显示加刺激剂的血小板裂解液，无论是用GST-mosein去结合GPIbβcp还是用GST-GPIbβcp结合mosein，得到的相应蛋白量都多于静息状态下的血小板裂解液。提示激活状态下mosein和GPIbβcp两者结合的更多，更紧密。针对两者结合的GPIbβ胞内段的关键序列，我们设计相应的GPIbα酶切刺激剂，进入胞内后竞争性结合moesin，在细胞水平观察到GPIbα酶切增多，上清GPIbα酶切产物增加。该刺激剂作用于血小板后，使得血小板对thrombin刺激剂的反应敏感性下降，提高了血小板活化的阈值。BioFlux system观察到刺激剂处理过的血小板，在毛细微血管中聚集的量明显减少。模式小鼠中，我们成功构建血管激光微损伤模型，初步实验结果表明以pal-RL处理过得小鼠血小板在激光诱导的动脉血栓模型中形成血栓的时间更长，上调GPIbα酶切会减缓血栓的形成。综上所述，我们提出了moesin与GPIbβ胞内近膜端相互作用抑制GPIbα酶切，这一作用在血小板活化的情况下更强烈，两者相互作用缺陷会减缓血栓形成。