Keap1-Nrf2信号通路在高压氧对小鼠急性移植物抗宿主病干预中的作用

Acute graft-versus-host disease(GVHD) is a major obstacle of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. It has no efficacy and applicated therapy methods. Now some studies find that hyperbaric oxygen(HBO) plays some role in immunosuppression，and has already been applied in skin and liver transplantation，which aims to reduce complications and prevent tissues or organs from rejection after transplantation. Our previous work has demonstrated that HBO contributes to alleviate of target organs impairments, reduct the pro-inflammatory cytokines IFN-γ and TNF-α，and improvement of survival time in acute GVHD mice. Nonetheless，the underlying mechanism remains unknown. Our present study focus on the nuclear related factor-2 related factor(Nrf2)，including its gene expression，transcription activity，protein concentration, and attempt to find the association between all of immune cell subgroups and ROS-Keap1/Nrf2 signaling pathway. In addition，we also would like to observe the potential effects of HBO in acute GVHD mice, which may provide a theoretical contribution as a novel approach of managing acute GVHD after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.

急性移植物抗宿主病（GVHD）是异基因造血干细胞移植的主要障碍，其病理过程是一个逐级放大的级联免疫反应，目前尚无特效疗法。现有研究表明高压氧（HBO）对机体免疫功能具有一定抑制调节作用，并在皮瓣、肝脏等移植中得到应用，以保护组织或器官不被排斥，减轻移植并发症。我们前期研究表明小鼠急性GVHD模型在HBO干预下靶器官病理损害减轻,TNF-α、IFN-γ分泌减少，生存期明显延长，但其确切作用机制尚不明。本课题拟以抗氧化基因表达的核因子2相关因子(Nrf2)的基因表达、转录活性、蛋白含量为研究切入点，探讨HBO干预下免疫细胞功能变化、亚群改变、因子释放以及靶器官病理生理改变与ROS-Keap1/Nrf2通路之间关系，并用Nrf2抑制剂阻断或激活剂激动该转录因子观察HBO干预效应。力图阐明HBO对小鼠急性GVHD具有防治作用的机制。为临床应用HBO作为一种新的措施来防治急性GVHD提供理论依据。

前期研究初步表明，经高压氧（HBO）干预下的急性GVHD小鼠其生存率较对照组高，同时其GVHD的临床表现及病理损害也较轻，但其作用机制尚不清楚。我们分析可能与HBO作用下细胞活性氧（ROS）生成与Nrf-2/ARE信号通路所致氧化应激效应有关。本研究结果表明，经C57小鼠作为供鼠、CB6F1小鼠作为受鼠构建的单倍体急性GVHD模型在实验过程中对高压氧耐受性良好，能够满足实验需要。（1）高压氧干预组（HBO组）的GVHD小鼠，在移植后14天，其脾脏T淋巴细胞ROS阳性表达率明显高于未进行高压氧干预的GVHD小鼠，而在移植后21天，随着小鼠GVHD症状改善，其ROS阳性表达率有所下降，并且在移植后28天，其ROS阳性表达率已恢复至与骨髓移植（BM组）相当水平；但未接受高压氧干预的GVHD小鼠，移植后14天，其脾脏T淋巴细胞的ROS阳性表达率并不高，但随着小鼠GVHD症状加重，在移植后21天及28天，其ROS阳性表达率明显高于HBO组与骨髓移植组小鼠。（2）通过检测Nrf-2/ARE信号通路相关影响抗氧化酶蛋白的转录因子发现，在移植后21天，HBO组小鼠脾细胞上游抗氧化基因Nrf-2、HO-1、GCLM的相对表达量较GVHD组升高；而在移植后28天，HBO组小鼠脾脏细胞Nrf-2相对表达量仍较高，但HO-1、GCLM的表达量已降低至GVHD组小鼠水平；而下游抗氧化基因GCLC、NQO1、Txrd1的相对表达量在移植后28天较GVHD组小鼠明显升高。（3）进一步检测外周血超氧化物歧化酶（SOD） 、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶后发现，在移植后的14天之内，HBO组小鼠外周血中SOD、GSH-Px的活性与未接受高压氧干预的GVHD小鼠相当；而在移植后的21天至28天，HBO组小鼠其SOD、GSH-Px的活性明显高于GVHD组小鼠。因此，通过上述研究我们发现，ROS-Nrf-2/ARE信号通路在高压氧引起的氧化应激中确实发挥了重要作用。我们初步推定其作用机制为：在高压氧的干预下，HBO引起了小鼠体内外源性的ROS增加，在移植后早期通过抑制供体T淋巴细胞的活化减少细胞因子释放，同时通过激活了Nrf-2/ARE信号通路相关基因，进而显著影响一系列重要的抗氧化酶的产生，从而通过抗氧化酶发挥解毒和抗氧化作用，对GVHD的发病过程起到一定程度的阻滞，达到防治GVHD目的。