温阳法对RSV感染哮喘小鼠支气管上皮细胞屏障作用的机制研究

呼吸道合胞病毒(RSV)感染是哮喘急性加重、致死的重要原因，支气管上皮细胞是RSV感染的主要场所，RSV对支气管上皮屏障功能有损伤作用。整合素与粘着斑激酶信号通道可能在病毒感染哮喘小鼠支气管上皮细胞抗病毒能力以及上皮屏障功能（迁移、粘附、增殖等自我修复中）起调控作用。本研究建立病毒性哮喘小鼠模型，用温阳法（中药咳喘六味合剂）干预后，分离和培养各组小鼠支气管上皮细胞，通过测定上皮细胞抗病毒能力以及支气管上皮屏障功能（粘附、迁移、增殖能力），通过Western blot法RT-PCR测定细胞内整合素αν、整合素β3、粘着斑激酶的蛋白及mRNA表达，以证实温阳法（中药咳喘六味合剂）可增强支气管上皮抗病毒能力，增加支气管上皮屏障功能，对整合素与粘着斑激酶信号通路可能存在一定的调控作用这一假说，为温阳法在防治病毒性哮喘方面提供新的机制研究。

40只SD大鼠随机分为PBS组、OVA组、RSV组、和OVA/RSV组4组。应用OVA腹腔注射致敏、OVA气道雾化吸入结合RSV滴鼻激发复制病毒性哮喘模型，PBS组不造模。观察大鼠哮喘发作症状；动物体描箱法测定乙酰甲胆碱激发条件下气道反应性（以Penh值表示）； H.E染色观察肺组织病理变化，以地高辛多标记点原位杂交检测肺组织中RSV RNA。发现运用OVA致敏、激发，以RSV连续滴鼻的方法制备大鼠病毒性哮喘模型，病理生理特征更符合哮喘定义；且用有活力的RSV感染诱发的哮喘与临床病毒性哮喘的实际发病情况相近，该模型的建立可以为哮喘研究提供更好的选择工具。.90只SD大鼠随机分为PBS组、OVA组、RSV组、OVA/RSV组及低、中、高剂量组7组。模型的建立同前。PBS组及各模型组以生理盐水灌胃，各治疗组均从造模第15天（即激发第一天）起以咳喘六味合剂灌胃直至处死。以动物体描箱法测定乙酰甲胆碱激发条件下气道反应性（以Penh值表示）；取肺组织，H.E染色观察肺组织病理变化，以地高辛多标记点原位杂交检测肺组织中RSV RNA；采用ELISA法测定血清中IL-4、IL-13、IFN-γ、IL-17、TGF-β1的含量。咳喘六味合剂可有效调节RSV感染哮喘模型大鼠外周血Th1/Th2、Th17/Treg比例失衡状态。不同剂量咳喘六味合剂干预大鼠后，其对各炎症因子的的抑制作用并不成量效递增关系，以中剂量组最为有效。此外，中剂量组对IFN-γ的促进作用优于低、高剂量组，但对IL-4、IL-13的抑制作用各治疗组类似，表明适宜剂量的咳喘六味合剂可能主要通过调控Th1细胞因子达到控制哮喘的目的。.各组大鼠造模给药后处死取肺组织，以Tunel检测肺组织细胞凋亡，取大鼠气管，采用Pronase E和DNase I联合消化法分离培养气道上皮细胞，以RT-PCR及western-blot检测气道上皮细胞ITG αv、ITG β3及FAK mRNA及蛋白的表达。咳喘六味合剂在干预RSV感染哮喘大鼠的过程中，除调控炎症因子的表达外，还有抑制病毒的增殖，减轻细胞凋亡或者促进细胞修复的作用。并主要通过调控细胞内ITG β3/FAK的信号通路起到促进气道上皮细胞粘附、增殖及损伤修复的作用，从而达到控制病毒性哮喘发作的目的，这也可能是其减轻病毒性哮喘发作的信号通路。