花粉SLF基因在沙田柚自交不亲和反应中的作用及机制研究

Self-incompatibility (SI) has a major impact on the quality and yield of Shatian pummelo fruits. Therefore, studying mechanisms of SI in Shatian pummelo is expected to yield information of practical value. Previously we identified one Citrus grandis Ribonuclease 3 (CgRNS3) that is specifically expressed in the style, possesses ribonuclease activity, and specifically inhibits the growth of self pollen tubes in vitro. To learn more about the mechanism of SI in Shatian pummelo, we performed a yeast two-hybrid screen. We found that an apparent citrus ortholog of SLF (S-locus F-box)—a component of SI in Rosaceae—interacts with CgRNS3. However, the impact of the interactions between SLF and CgRNS3 on SI is not clear. The goals of the propose work are to (1) analyze the interactions between SLF and CgRNS3 in growing pollen tubes using immunofluorescence localization and in vitro immunoprecipitation assays, (2) identify relevant protein-protein interaction domains using double fluorescent complementary experiments with citrus protoplasm, and (3) determine what signaling events (e.g., calcium signals, microfilament cytoskeleton, ROS, or PCD) participate in SI and act downstream of the interactions between CgRNS3 and SLF using an in vitro induction of pollen incompatibility system combined with antisense oligonucleotide silencing technology. Results from these analyses will provide a fundamental basis and an in-depth understanding of the functional and mechanismic contrubtion of SLF to SI in Shatian pummelo.

自交不亲和性是制约沙田柚（Citrus grandis Osbeck）果实产量及品质的重要因素，因此，研究沙田柚自交不亲和机制具有重要的实际意义。前期研究中，我们从沙田柚花柱中分离鉴定了一个可以特异性抑制沙田柚花粉管生长的核糖核酸酶CgRNS3，并通过酵母双杂交筛选到与其互作的花粉特异表达蛋白SLF。然而，SLF响应CgRNS3进而引起自交不亲和反应的作用机制并不清楚。本项目拟利用免疫荧光定位及离体免疫沉淀实验阐明SLF在花粉管中与CgRNS3结合；利用双分子荧光互补实验在柑橘原生质体中鉴定SLF结合CgRNS3的具体作用区域；利用离体诱导花粉不亲和系统结合反义寡核苷酸沉默技术鉴定SLF参与不亲和反应的功能；进而检测花粉管中钙信号、微丝骨架、ROS及PCD下游应答事件，最终明晰沙田柚花粉SLF参与自交不亲和反应的作用及机制，为沙田柚自交不亲和机理研究和遗传改良提供理论基础。

自交不亲和性是制约芸香科柑橘如沙田柚（Citrus grandis Osbeck）果实产量及品质的重要因素，因此，发掘沙田柚自交不亲和性关键基因，有助于解析沙田柚自交不亲和的作用机制，进而为有针对性地进行遗传改良培育自交亲和沙田柚新种质奠定理论基础。然而关于控制芸香科柑橘沙田柚自交不亲和关键雄蕊决定因子至今不明，因此筛选控制柑橘自交不亲和性的雄蕊决定因子成为当务之急。项目组利用原始、野生及栽培柑橘资源重点开展了控制柑橘自交不亲和关键雄蕊决定因子SLF的发掘及鉴定工作，取得重要进展。在砂糖橘中发掘并鉴定出花粉部位亲和突变体材料；利用前期获得的控制柑橘自交不亲和关键雌蕊决定因子S-RNase为诱饵，筛选构建好的沙田柚BAC文库，成功获得了包含雌雄蕊决定因子S-RNase与SLF的S位点完整信息，通过S位点信息分析结合群体遗传连锁分析，首次发掘并鉴定到与S-RNase在遗传上紧密连锁的候选花粉决定因子SLF，通过系列生化实验，明确SLF可以形成泛素化复合体特异性降解花柱S-RNase酶。基于柑橘自交不亲和机制研究遗传特性，开发出鉴定自交亲和性分子标记用于早期育种选择，即苗期可快速鉴定是否具有自交亲和特性的柑橘单株，提高筛选效率。研究结果在理论上丰富了柑橘自交不亲和作用机制，为未来开展柑橘自交不亲和设计育种提供了基因资源和理论基础。