HDACi-CI994对猪体细胞核移植胚胎表观遗传重编程的作用机制研究

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) technology can make fully differentiated somatic cells into totipotent embryonic cells via a complicated reprogramming procedures. Therefore, SCNT has wide applications in basic research and regenerative medicine. Because unclear mechanisms of somatic cell reprogramming result in low developmental capacity of reconstructed embryos, it limits the applications of SCNT. Previous studies have shown that abnormal histone modifications and aberrant zygote genome activation should induce failure development of cloned embryos when compared with fertilized embryos. In our preliminary experiments, CI994, a histone deacetylase inhibitor, can significantly improve the in vitro development of cloned embryos by accelerating histone acetylation. However, the mechanism by which CI994 act has not been determined. In this project, we will investigate the key signaling pathways/genes of epigenetic reprogramming in HDACi-mediated porcine SCNT embryos by single cell RNA-sequencing technology. Thus, it will provide us a new orientation to elucidate the molecular mechanism of nuclear transfer.

体细胞核移植（SCNT）可以将终末分化的体细胞重编程为具有全能性的胚胎细胞，在基础研究以及再生医学方面都有很大的应用潜能。但由于体细胞重编程的机理不清楚导致克隆胚胎发育能力低下限制了其应用。研究结果表明，核移植胚胎与正常受精的胚胎相比，在组蛋白修饰及合子基因组激活方面都存在异常，这可能是导致克隆胚胎发育失败的原因。我们的前期研究发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）CI994能够提高组蛋白乙酰化水平并能显著促进克隆胚胎的体外发育能力。但是，CI994如何影响克隆胚胎重编程的分子机制不是很清楚。在本项目中我们拟利用单细胞RNA测序技术，重点探讨HDACi介导的影响猪SCNT胚胎表观重编程的关键信号通路/基因，为进一步了解体细胞核移植的分子机制提供新的视角。

体细胞核移植（SCNT）可以将终末分化的体细胞重编程为具有全能性的胚胎细胞，由于供体细胞核异常的表观遗传修饰，大部分胚胎在合子基因组激活（ZGA）阶段发生阻滞。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）能够提高组蛋白乙酰化水平，促进克隆胚胎的体外发育能力，但其机理尚未明确。因此本研究以HDACi—CI994为研究对象，旨在阐明HDACi对猪SCNT胚胎表观遗传重编程作用的分子机制。首先采用单细胞 RNA-seq技术对体外受精和SCNT胚胎差异表达基因进行转录组测序，结果共筛选出84个差异基因。其次，用CI994处理SCNT胚胎，结果表明10uM CI994处理重构胚胎24h，囊胚形成率显著高于其他处理组及未处理组，囊胚中凋亡细胞率显著低于对照组。H3K9和H4K12乙酰化水平免疫荧光分析显示，10uM CI994处理可显著提高SCNT胚胎原核时期H3K9和H4K12乙酰化水平。此外，与对照组相比10uM CI994处理可显著提高多能性相关基因POU5F1和SOX2的mRNA表达水平。为了深入探究CI994促进体细胞核重编程的分子机制，进一步对CI994处理和未处理胚胎进行单细胞基因测序，共筛选出包括FGF21基因在内的28个差异基因。利用mRNA显微注射的方法过表达FGF21，结果发现过表达FGF21显著提高克隆胚胎囊胚率，并且提高4-细胞、囊胚期组蛋白H3K9、H4K12乙酰化水平及囊胚时期POU5F1和SOX2等多能性转录因子的表达水平。本项目描绘了猪正常胚胎和SCNT胚胎ZGA时期基因表达，并且找出猪胚胎发育阻滞相关或促进猪胚胎发育的关键性基因，阐明了组蛋白去乙酰化酶抑制剂对猪SCNT胚胎表观遗传重编程的作用机制。希望通过这项研究将帮助我们更好地了解体细胞核重编程的机制和主要的阻碍因素，进一步提高核移植效率推进体细胞核移植的应用。