丛生蛋白对血视网膜屏障的作用及机制研究

Proliferative diabetic retinopathy(PDR) and diabetic macular edema(DME) are the leading causes of vision loss in patients with diabetes mellitus. Blood retinal barrier breakdown is closely associated with PDR and DME, however, less studies exist about drug for therapy of blood retinal barrier breakdown, because the mechanism underlying blood retinal breakdown is not well understood. We found that clusterin was downregulated in the PDR vitreous. However, the regulatory mechanism of clustein undergoing blood retinal barrier is largely unknown. RT-PCR, immunofluorescence staining, gelatin zymography and RNA interference will be applied to measured the expression of the tight junction proteins and the matrix metalloproteinases in human retinal microvascular endothelial cells and diabetic rat model, and the effect of clusterin on the permeability of the blood retinal barrier. As a result, it will be clarified that the role of clusterin in blood retinal barrier and the regulatory mechanism, These data will widen the scope of potential avenues for new prevention and therapy of PDR and DME.

增生性糖尿病视网膜病变(PDR)及糖尿病性黄斑水肿（DME）是引起糖尿病患者视力下降的主要原因，而血视网膜屏障的破坏与PDR及DME的发生密切相关，目前干预治疗的药物研究较少，主要是血视网膜屏障破坏的作用机制尚未完全阐明。我们前期研究发现丛生蛋白（clusterin）在PDR患者的玻璃体中明显下调，但其对血视网膜屏障的作用及其调控机制尚不清楚，本项目将应用RT-PCR、免疫荧光染色、明胶酶谱分析、RNA干扰等技术从体外培养的人视网膜微血管内皮细胞及糖尿病大鼠动物模型两方面研究丛生蛋白对血视网膜屏障通透性的影响以及如何调控紧密连接蛋白及基质金属蛋白酶的表达，从而阐明丛生蛋白对血视网膜屏障的作用及调控的分子机制，为将来防治PDR及DME提供新的思路。

糖尿病性视网膜病变（Diabetic retinopathy, DR）是严重影响患者视力的视网膜疾病。本课题组前期对DR患者的玻璃体的蛋白进行分析，结果显示DR患者的玻璃体中丛生蛋白（Clusterin，CLU）表达水平下调。本课题研究CLU在早期DR中对血视网膜屏障 (BRB) 和神经视网膜的保护作用及机制。具体包括：CLU的来源，CLU的表达水平与视网膜血管内皮细胞间紧密连接蛋白表达及血管通透性的关系，CLU对神经视网膜细胞丢失的抑制作用，探索CLU是否可作为DR的保护因子。.结果显示： CLU高表达于增生膜血管的内皮细胞中；CLU和DR组大鼠体重明显低于对照组，血糖明显高于对照组；玻璃体腔注射CLU后1d，房水中CLU的浓度2倍高于对照组 (*p<0.05)； DR组大鼠视网膜的细胞间连接蛋白的转录水平明显低于对照组（*p<0.05），而CLU组大鼠视网膜的细胞间连接蛋白转录水平显著高于DR组（*p<0.05）；大鼠视网膜铺片荧光染色后的Occludin/lectin相对定量结果显示DR组大鼠的荧光强度相对值较对照组(明显降低(*p<0.05); 而CLU组的荧光强度相对值降低程度显著减少(*p<0.05,)。FFA结果显示DR组大鼠 (100%) 出现微血管异常，而CLU组只有部分大鼠 (30%)出现上述微血管改变。 ERG检查显示：DR组大鼠的b波值较对照组大鼠明显降低 (*Pb1<0.01); 而CLU组b波降低的程度显著减少(*Pb3<0.05); HE染色结果表明，DR组大鼠较对照组大鼠神经视网膜细胞计数减少 (*p<0.05), 而CLU组大鼠较DR组大鼠神经视网膜细胞减少个数显著降低 (*p<0.05); Tunel结果显示，DR组大鼠神经视网膜细胞存在Tunel阳性细胞 (*P<0.05), 而玻璃体腔注射CLU后Tunel阳性细胞个数明显减少 (*P<0.05) 。.CLU主要来源于视网膜血管内皮细胞；外源性增加CLU可抑制糖尿病大鼠BRB的损害；，可减少糖尿病大鼠在FFA中出现高荧光点和血管迂曲等视网膜血管异常；可部分降低糖尿病大鼠的视功能损害，抑制糖尿病大鼠视网膜变薄，内外核层细胞的变少。蛋白组学发现的DR玻璃体差异蛋白CLU是DR的保护因子，可作为DR治疗的新靶点。