双生病毒DNAβ复制相关顺式元件对复制效率和专化性的影响

双生病毒与伴随卫星DNAβ形成一类新型的病害复合体，已在亚洲、非洲等多个国家造成毁灭性灾害。已有研究表明，DNAβ能与多种双生病毒互作，对病害流行起重要作用。我们的研究发现，该类卫星的复制缺乏严格的专化性，但辅助病毒对不同卫星复制的能力和效率存在显著差异，其机制尚不清楚。本项目拟利用已构建的多种双生病毒和DNAβ侵染性克隆，通过假重组实验，分析辅助病毒对不同DNAβ复制效率和专化性的差异；进而对DNAβ分子复制原点（Ori）进行缺失、突变和置换分析，鉴定卫星Ori中与复制相关的顺式作用元件；并测定Rep蛋白与此顺式元件的体外结合能力，分析体外结合与体内复制的相关性，揭示DNAβ Ori内相关顺式元件与卫星复制效率和专化性的关系。本研究的实施将有望明确卫星在病毒致病和病害流行中的作用，阐明辅助病毒编码的Rep蛋白介导的DNAβ复制专化性和效率的分子机理，为此类病害的预防和治理提供理论依据。

部分单组份病毒，如中国番茄黄曲叶病毒（Tomato Yellow leaf cure China virus, TYLCCNV）和烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus, TbSCV)，伴随一类与致病相关的卫星分子（betasatellite或DNAβ）。DNAβ分子可以被同源或异源辅助病毒复制，但当同源和异源卫星与某一辅助病毒同时存在时，同源卫星被选择性地稳定复制，但其分子机制尚不清楚。本项目对单组份双生病毒卫星复制专化性的分子机制进行了研究，鉴定了与卫星特异性复制相关的位置原点及其顺式作用元件，并明确了辅助病毒复制蛋白与卫星顺式作用元件特异性结合从而介导复制专化性的作用机制。我们构建了TYLCCNV和 TbSCV辅助病毒及卫星的侵染性克隆，明确了复合侵染中双生病毒对卫星复制维持的选择性。在此基础上通过置换相应片段，并构建了突变体病毒和卫星侵染性克隆，发现DNAβ基因间隔区内270 bp 左右的LCR 区段包换卫星复制的原点，是卫星DNAβ复制所必须的。该区域的序列决定了复制专化性，且这种复制专化性是由辅助病毒上的复制蛋白(Rep, AC1)介导的。序列比较分析发现，LCR 片段中存在一个含有重复序列的模体（RBM），该重复序列在TYLCCNV 和TbCSV 的卫星DNAβ 存在差异。体内DNA足迹分析发现，TYLCCNV和 TbSCV Rep可结合保护RBM序列；凝胶阻滞试验和竞争性结合试验证明，辅助病毒的Rep与其同源的RBM 的结合能力强于其与异源的RBM 的结合能力。通过构建该结构域的置换或缺失突变体侵染性克隆并且接种本氏烟，证实了该序列模体决定了这两种病毒卫星DNAβ复制的专化性。此外，我们还在田间样品中鉴定了一个缺陷性重组DNAβ分子，该分子可被辅助病毒在植物体内稳定复制。进一步分析发现，该卫星分析也含有类似的重复序列，表明类型重复序列可能在双生病毒中普遍存在。