杆状病毒复制过程中病毒DNA甲基化动态及其对病毒复制和基因表达的影响

许多感染真核生物的DNA病毒，其复制和基因表达受宿主细胞表观遗传学机制影响,而病毒也会利用这些机制确保感染顺利进行。认识病毒与细胞在表观遗传学层面的相互作用对充分认识病毒的复制机制有重要意义。本项目拟以杆状病毒为对象，研究病毒裂解性复制过程中病毒DNA甲基化的动态及其对病毒复制、病毒基因表达的影响。本课题组前期研究发现，该病毒复制过程中病毒DNA甲基化程度呈规律性的变化，一些关键区域甲基化的动态变化尤为明显。本项目将通过遗传学、生物化学和分子生物学方法，全面研究病毒复制过程中病毒DNA甲基化动态规律，发现基因组中的甲基化热点，分析病毒特定位点甲基化对病毒复制和基因表达的影响及机制，以期对以杆状病毒为代表的裂解性病毒在复制过程中DNA甲基化的意义有更深入的认识。研究成果可望为改进杆状病毒蛋白表达系统和杆状病毒生物杀虫剂提供新思路，对认识病毒与细胞间表观遗传相互作用也有重要意义。

细胞表观遗传机制是生物体基因表达调控的重要机制之一，也是生物表型差异的重要原因。病毒依赖宿主细胞进行复制，在一定程度上受到细胞表观遗传机制的影响。虽然人们对一些潜伏性或持续性感染的病毒，如HIV，EBV等，受表观遗传机制调控的问题有较深入的认识，但对于裂解性病毒是否也受到表观遗传调控的问题，尚缺少研究。本研究以杆状病毒为对象，研究病毒裂解性复制过程中病毒DNA 甲基化的动态及其对病毒复制、病毒基因表达的影响。.（1）AcMNPV 基因组甲基化水平和动态：DNA甲基化测序发现，AcMNPV基因组整体DNA甲基化水平低（小于1%）；但个别区域甲基化水平较高，尤其是ie0/ie1部分区域（3～8%）。病毒粒子中甲基化水平偏高，而在感染后8小时有明显降低，随后逐渐有所上升。对全基因组进行高通量甲基化测序，证实其甲基化水平低于预期。.（2）DNA甲基化对病毒复制的影响：利用体外甲基化实验发现DNA甲基化对病毒启动子的活性有较大的影响，但影响不一。ie1和ie0启动子的活性受到甲基化修饰的强烈抑制，pe38启动子活性受到部分抑制；同时滞早期启动子p35、DNApol、lef1、lef3、lef8的启动子则在甲基化处理后得到一定程度的激活。AcMNPV感染会使甲基化的影响缩小甚至消失。在DNA甲基转移酶抑制剂DAC处理的细胞中制备低甲基化水平的病毒，发现该病毒的基因表达发生变化、DNA复制有所加快，对幼虫的感染力也有所上升。.（3）ie0/ie1区域甲基化状态与基因表达的关系：发现DNA甲基化极大降低ie0启动子和ie1启动子的活性，IE0和IE1蛋白对甲基化的ie1启动子仍有激活作用，但不同比例的IE0/IE1下，甲基化与未甲基化的ie0启动子的活性并不一致，IE0水平高时，未甲基化的ie0启动子活性更强；随着IE1比例上升，甲基化的ie0启动子活性上升。.（3）DNA甲基化相关机制研究：鉴定了Sf9细胞的DNMT1，2基因，对DNMT2进行了酶学和晶体结构的研究。研究发现DNMT2在病毒感染后表达水平未受影响，但DNMT1在病毒感染后4小时表达水平明显降低，而通过RNA干扰和过表达DNMT2对病毒DNA甲基化水平的影响不明显。还研究了可能与DNA甲基转移酶招募有关的组蛋白甲基化及其关键酶SUV3-9的结构和功能。.本课题的研究结果表明，DNA甲基化在病毒复制和基因表达调控中发