一种新发现的登革病毒顺式作用元件DCS-PK的复制调控作用研究

Dengue viruses type 1-4 are members of genus flavivirus wtihin the family flaviviridae. The genome of dengue virus is a single-stranded positive sense RNA molecule, which contains multiple cis-acting elements, including viral promoter and other regulational elements,all of which are critical for viral RNA replication. Recently, we have identified a novel cis-acting element, termed as DCS-PK (pseudoknot downstream of 5′ cyclization sequence)，in the C-coding region of dengue virus. In this proposal, to characterize the structure and function of DCS-PK element and unveil the mechanism how it regulates viral RNA replication, RNA secondary structure prediction, sequence aligment and biochemical methods will be applied to determine the structure of DCS-PK. Based on its structure information, a series of mutations targeting different sites of DCS-PK will be generated, and the impact of these mutations on the folding of DCS-PK and on viral RNA replication will be studied by the use of RNase digestion /chemical modification technique together with replicon and infectious clone system, respectively. Furthermore, electrophoretic mobile shift assay (EMSA) and RNA affinity chromatography will be utilized to study the potential interactions between DCS-PK and other viral cis-acting elements, viral RNA replication-related proteins and host proteins. This project will contribute to the understanding of dengue virus replication mechanism and provide novel targets for the rational design and development of anti-dengue drugs.

登革病毒为黄病毒科黄病毒属成员，基因组为单股正链RNA分子，其中包含多个顺式作用元件，在登革病毒基因组复制过程中发挥关键作用。最近，我们在登革病毒C蛋白编码区内发现了一个新的复制调控元件DCS-PK。为阐明该元件的结构与功能，本项目首先通过生物信息学方法进行序列比对和二级结构预测,结合RNase消化实验和化学修饰方法对预测结构进行验证；在此基础上，构建一系列DCS-PK元件突变体，分别利用病毒复制子/感染性克隆技术分析上述突变对DCS-PK元件结构和病毒RNA复制的影响；进一步利用凝胶迁移实验及RNA亲和层析等手段对DCS-PK元件与其它顺式作用元件，病毒复制相关蛋白及宿主蛋白的相互作用进行研究。该项目的开展将为深入阐明登革病毒的复制机制奠定基础，并可为抗病毒药物设计提供新的靶标。

黄病毒属包括众多人类病原体，如登革病毒、西尼罗病毒、黄热病毒以及最近引起全球关注的寨卡病毒等。本项目围绕黄病毒基因组中新发现的DCS-PK及UFS结构元件，通过一系列体内与体外技术平台对它们的结构与功能展开研究，从而阐明黄病毒属病毒RNA复制的关键机制。.本研究首先通过序列比对和二级结构预测发现DCS-PK元件在蚊媒黄病毒C蛋白编码区内高度保守，并进一步通过RNase切割实验和2′-羟基选择性酰基化结合引物延伸分析(SHAPE)证实DCS-PK具有高度有序的三茎假结结构；以登革病毒为模型，通过体外EMSA试验，我们发现DCS-PK元件可促进病毒5′ RNA与3′ RNA的结合，而基于反向遗传学的突变分析则表明DCS-PK元件是保证病毒RNA有效复制的必要条件。因此，DCS-PK元件通过促进病毒基因组的环化从而增强病毒RNA的复制，且上述功能严格依赖于其二级结构和三级结构。.在此基础上，我们通过深入的RNA二级结构预测与序列比对，结合基于不同黄病毒5′ RNA的SHAPE分析，在黄病毒基因组5′ 末端又发现了一个全新的保守RNA调控元件UFS。体外EMSA及RdRp活性试验证实UFS元件对于5′ SLA元件募集病毒RNA聚合酶的功能具有明显的促进作用。进一步利用登革病毒和寨卡病毒的反向遗传学系统证实，突变破坏UFS元件的二级结构可显著降低病毒RNA的复制，而引入互补突变使UFS的结构恢复则可将病毒RNA复制水平提高到接近野生型病毒的水平。有趣的是，在病毒基因组处于不同构象下，该元件具有双链及解链两种不同的构象，且提高UFS元件结构的稳定性可导致病毒基因组的环化效率及病毒RNA的复制均明显降低。而体外试验表明病毒基因组环化所介导的UFS元件解链现象可引起病毒基因组5′末端与病毒RNA聚合酶之间的亲和力减弱。基于上述发现，我们提出，UFS元件的构象由病毒基因组环化所控制，其目的是实现病毒RNA聚合酶募集的动态变化，从而满足病毒基因组复制不同阶段的需求。.本研究对DCS-PK及UFS元件功能的阐明，尤其是黄病毒基因组复制调控新模型的提出，加深了对RNA病毒复制调控的理解，并为抗黄病毒药物的研发提供了新的靶点与思路。