1,25(OH)2D3 通过调节ASAP2基因表达促进巨噬细胞胞葬作用的机制研究

Normal macrophage efferocytosis can inhibit autoimmune and chronic inflammation, which underlies the aetiology and development of autoimmune diseases including Multiple Sclerosis. It has been found that 1,25(OH)2D3 can upregulate the expression of gene ASAP2, which is a Multiple Sclerosis risk gene and involved in regulating cytoskeleton. The applicant also found that 1,25(OH)2D3 potentially increased the efferocytosis of macrophages. Therefore, we hypothesize that 1,25(OH)2D3 can promote macrophage efferocytosis by upregulating the expression of ASAP2. The applicant also found there was a super-enhancer region bound by vitamin D receptor (VDR) in gene ASAP2, which has been pre-occupied by PU.1. And this class of super-enhancers is enriched for RUNX3 motif. Based on it, this project plan to further focus on the interaction between Vitamin D receptor, super-enhancer, PU.1, and RUNX3, which underlies the molecular mechanism of ASAP2 transcription. Furthermore, we plan to verify the association between Multiple Sclerosis, efferocytosis, and ASAP2 by using mouse EAE model. This research will reveal the mechanism of 1,25(OH)2D3 in regulating efferocytosis, clarify the transcriptional mechanism of ASAP2, and lay the foundation for further exploration on efferocytosis in Multiple Sclerosis.

巨噬细胞通过胞葬作用清除凋亡细胞，具有抑制自身免疫和慢性炎症的作用，影响多发性硬化等自身免疫性疾病的发生和发展。前期研究显示活性维生素D可以显著上调基因ASAP2的表达，而ASAP2是多发性硬化风险基因且参与细胞骨架的调节。申请人还发现活性维生素D潜在提高了巨噬细胞的胞葬能力。因此假设：活性维生素D（1,25(OH)2D3）通过上调ASAP2表达促进巨噬细胞胞葬作用。申请人发现在ASAP2基因内有维生素D受体结合的超级增强子存在，被PU.1预结合，且该类超级增强子富集RUNX3结合基序。因此拟重点研究巨噬细胞中活性维生素D通过其受体与超级增强子、PU.1和RUNX3共同调节ASAP2转录的分子机制。并进一步通过小鼠EAE模型验证多发性硬化和胞葬以及ASAP2表达的相关性。本研究将揭示活性维生素D调节胞葬表型的通路机制，阐明ASAP2基因的转录机制，并为多发性硬化胞葬表型的深入研究奠定基础。

维生素 D 的活性形式，即1,25(OH)2D3，可调节免疫系统起到抗炎作用，尤其是通过调节巨噬细胞介导的先天免疫。我们之前的研究识别出THP-1 细胞中ArfGAP with SH3 Domain, Ankyrin Repeat and PH Domain 2（ASAP2）基因的1,25(OH)2D3反应区域和VDR 结合的超增强子区域。这里我们探索了1,25(OH)2D3通过VDR超级增强子调节ASAP2（编码GTP酶激活蛋白）转录的机制以及ASAP2的潜在功能。首先，我们验证了THP-1 细胞和巨噬细胞中1,25(OH)2D3对ASAP2的上调。然后，我们在ASAP2的VDR超级增强子中确定了三个调节区域（即核心区域、1,25(OH)2D3 响应区域和抑制区域）。我们发现在体外ASAP2可以促进 RAC1活性，进而促进巨噬细胞胞葬作用。在体内，1,25(OH)2D3可以减少实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠脊髓中凋亡细胞的数量并且可促进腹膜炎中的巨噬细胞胞葬作用，但对整体ASAP2 mRNA水平改变不明显。通过这项研究，我们可以更好地了解 ASAP2 转录的调控机制和其与胞葬的关系，可以作为炎症性疾病的潜在治疗靶点。此外，我们还研究了维生素D代谢基因多发性硬化（MS）风险单核苷酸多态性位点（SNP）与MS病人外周血单个核细胞的关系，发现等位基因rs2248359-C对Th1和Th17.1比例的抑制作用和rs703842-AA对IL-2水平的抑制作用。通过生信分析我们还研究发现骨肉瘤中巨噬细胞标记基因FCER1G和TYROBP高表达组有更强的免疫浸润和更好的预后。我们还通过质谱和 RNA测序进一步探索了ASAP2的功能。在THP-1源性细胞中我们发现 ASAP2 可以上调抗病毒相关基因的表达，并与SAM and HD domain containing deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase 1（SAMHD1）相互作用。在胃癌细胞系AGS中我们发现ASAP2可以和Rho GTPase Activating Protein 21（ARHGAP21）互相作用，调节线粒体的能量代谢。