1,25(OH)2D3 在抗皮肤和骨骼衰老中的作用机制研究

To determine whether 1,25(OH)2D3 plays a role in preventing aging in skin and skeleton,the homozygous Bmi-1 gene knockout mice with severe defects in antioxidative function used as aging model will be supplemented with 1,25(OH)2D3 or antioxidant.Phenotypes of skin and skeleton from mice will be analyzed including cellular proliferation, apoptosis and senescence and angiogenesis,osteoblastic bone formation and osteoclastic bone resorption related parameters,by techniques of histopathology, cellular and molecular biology to assess whether 1,25(OH)2D3 and antioxidant can rescue the premature senescence phenotypes in skin and skeleton of homozygous Bmi-1 gene knockout mice. The oxidative stress and DNA damage related parameters will be examined in skin and skeleton by flow cytometry, Western blots, Real-time RT-PCR and immunohistochemistry to determine whether 1,25(OH)2D3 can play a role in postponing skin and skeletal aging through its antioxitative action. Results from this study will be helpful to elucidate mechanisms of active vitamin D in preventing aging and will provide theoretical and experimental basis for the applications of sufficient vitamin D in clinical study on postponing aging.

为了明确1,25(OH)2D3在抗皮肤和骨骼衰老中的作用及机制，我们拟利用抗氧化功能严重障碍的Bmi-1基因敲除纯合子小鼠作为研究模型，分别给予1,25(OH)2D3和抗氧化剂，利用组织病理学、细胞生物学和分子生物学的方法，比较分析各实验组动物皮肤和骨骼的表型变化，包括细胞增殖、凋亡、衰老和新生血管发生以及成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收相关指标的检测，观察1,25(OH)2D3是否与抗氧化剂一样，能够部分或完全纠正Bmi-1基因缺失纯合子小鼠的皮肤和骨骼衰老表型；利用流式细胞仪技术、蛋白质印迹、实时荧光定量RT-PCR以及免疫组化等方法检测上述动物的皮肤和骨骼的氧化应激以及DNA损伤相关指标，观察1,25(OH)2D3是否能够通过提高抗氧化作用，延缓皮肤老化和骨骼衰老。本研究不仅有助于阐明活性维生素D在抗衰老中的作用机制，而且将为活性维生素D运用到延缓衰老的临床研究提供理论和实验依据。

为了明确 1,25(OH)2D3 在抗皮肤和骨骼衰老中的作用及机制，我们利用抗氧化功能严重障碍的 Bmi-1 基因敲除纯合子小鼠作为研究模型，给予 1,25(OH)2D3，利用组织病理学和分子生物学的方法，比较分析各实验组动物皮肤和骨骼的表型变化，观察 1,25(OH)2D3 是否能够纠正 Bmi-1基因缺失纯合子小鼠的皮肤和骨骼衰老表型；结果发现1,25(OH)2D3不能纠正Bmi1-/-小鼠的皮肤及骨骼衰老表型。接着我们发现Bmi1蛋白表达水平在1α(OH)ase-/-小鼠皮肤和骨骼组织中明显降低，而外源性给予1,25(OH)2D3明显上调Bmi1蛋白在野生型小鼠皮肤和骨骼组织中的表达水平。这些结果说明1,25(OH)2D3的抗氧化作用可能经过Bmi1介导。我们通过饮水补充抗氧化剂乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC，1mg/ml)予3周龄Bmi1-/-小鼠，持续2周或至死亡，利用影像学、病理组织学和细胞分子生物学的方法比较分析它们与正常饮水Bmi1-/-或WT小鼠表型差异。与未处理Bmi-1-/-小鼠相比，NAC补充使Bmi1-/-小鼠生存期延长、体重增加、骨骼生长改善，Bmi1-/-小鼠的骨密度、皮质骨和小梁骨容量、成骨细胞数、碱性磷酸酶(ALP)和I型胶原阳性面积以及矿物质沉积率均明显增加，而骨髓脂肪细胞数、8-羟基-2’-脱氧鸟苷（8-OHdG）阳性或β-半乳糖苷酶阳性骨细胞百分率以及PPARγ、γ-H2AX和p16INK4a蛋白水平均明显下降；同时，骨组织氧化应激参数包括过氧化氢浓度和MDA含量均显著降低，而骨组织抗氧化酶类相关参数包括总抗氧化能力，谷胱甘肽浓度，超氧化物歧化酶活性和蛋白含量均明显增加。体外培养小鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSC）结果显示：NAC补充Bmi1-/-小鼠来源BM-MSC的总成纤维细胞集落形成(CFU-f)和ALP阳性CFU-f数量、Runx2蛋白水平和细胞增殖能力均明显增加，而油红阳性细胞数，凋亡细胞数及PPARγ和p16蛋白表达水平均明显降低；活性氧水平明显下降，而谷胱甘肽还原酶，谷胱甘肽过氧化酶1和4及硫氧还蛋白基因表达水平均上调。这些结果表明，Bmi1能通过抑制氧化应激诱导骨细胞衰老而发挥延缓骨骼衰老的重要作用。