二妙散干预类风湿关节炎胆碱能抗炎通路的作用机制研究

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic multi-system autoimmune disease with high incidence, unclear pathogenesis. Er-miao-san is clearing away heat and dehumidification, and curing joint diseases. It is a classic prescription for the treatment of RA by Chinese medicine. The cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) plays an important role in regulating the transmission of various inflammatory signals in immune cells. The α7 acetylcholine receptor (α7nAChR) is the core of vagal regulation of inflammatory regulation, and its regulatory gene CHRNA7 is the most important target gene. Previous research by our research team found that CHRNA7 regulates the expression of key genes in RA-related signaling pathways, and Er-miao-san significantly down-regulates the expression of CHRNA7. We hypothesize that Er-miao-san plays a role in the treatment of inflammatory diseases such as RA by mobilizing the cholinergic anti-inflammatory pathway. Therefore, this study intends to use CIA rats as the research object, cut the cholinergic anti-inflammatory pathway through the vagus nerve cutting technique in vivo, over-express and knock-down the CHRNA7 adenoviral vector transfected synovial fibroblasts (FLS), including four levels of individuals, tissues, cells and molecules clarify the mechanism of action of Er-miao-san in the treatment of RA through the cholinergic anti-inflammatory pathway, providing an important theoretical and experimental basis for targeted therapy of RA.

类风湿关节炎（RA）是一种复杂的慢性多系统自身免疫性疾病，发病率高，发病机制不明。二妙散清热除湿、通利关节，是中医治疗RA的经典方。胆碱能抗炎通路（CAP）在调节免疫细胞多种炎症信号的传导中起重要作用，α7乙酰胆碱受体（α7nAChR）是迷走神经实现炎症调节作用的核心，其调控基因CHRNA7是该途径最重要的靶基因。本课题组前期发现，CHRNA7在胶原佐剂诱导的CIA大鼠滑膜中高度表达，可能是治疗RA的关键靶基因；二妙散显著下调CHRNA7的表达。我们推测，二妙散通过调动胆碱能抗炎通路，发挥治疗RA等炎症性疾病的作用。因此，本课题拟以CIA大鼠为研究对象，通过迷走神经干切断术在体阻断胆碱能抗炎通路，过表达和敲低CHRNA7转染滑膜成纤维细胞，从个体、组织、细胞和分子4个水平阐明二妙散通过胆碱能抗炎通路治疗RA的作用机制，为靶向治疗RA提供理论和实验基础。

【背景】类风湿关节炎（RA）是一种复杂的慢性多系统自身免疫疾病，累及多个脏器，发病率高，发病机制不明，且无特效治疗方法。二妙散出自《丹溪心法》，清热除湿、通利关节，是中医治疗RA的经典方，其作用机制鲜见报道。胆碱能抗炎通路（CAP）在调节免疫细胞多种炎症信号的传导中起重要作用，α7乙酰胆碱受体（α7nAChR）是迷走神经实现炎症调节作用的核心，其调控基因CHRNA7是该途径最重要的靶基因。【研究内容】通过建立CIA大鼠模型，分析不同试验组大鼠心、肝、脾、肺、肾和关节中CHRNA7、Gnαq、CCR3、CCR5、CCR7、CCL5、CXCR3、CXCR4和CXCL10 mRNA和蛋白水平的表达，免疫组化技术进行定位，对于了解CHRNA7在不同组织中的表达差异，以及通过CAP靶向治疗RA具有重要的理论及临床意义。不同浓度二妙散对CIA大鼠灌胃治疗，研究二妙散对CIA大鼠调控基因CHRNA7、NF-κBp50、ERK1/2、TLR4、PI3KA和Gnαq表达的影响。切断CIA大鼠单侧迷走神经，探究二妙散通过ChAT/α7nAChR/NF-κB信号途径对RA的调控作用。从CIA大鼠关节滑膜中分离纯化培养成纤维样滑膜细胞（FLS）；研究不同浓度二妙散水提物对CIA大鼠FLS增殖、迁移和炎性因子表达的影响。研究汉黄芩素对类风湿关节炎大鼠成纤维细胞样滑膜细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和炎症反应的影响；并基于胆碱能抗炎通路探索其作用机制。【结果及结论】本研究成功构建CIA大鼠模型，NF-κBp50和 ERK1/2、TLR4 和 PI3KA 在不同实验组大鼠关节组织中均有不同程度的表达，二妙散对于减少炎症因子和增加抑炎因子的表达具有重要作用。二妙散可能通过ChAT介导α7nAChR高表达，从而下调NF-κBp50/ p65，进而显著减少CIA大鼠炎症因子释放，缓解脾脏及关节病变，缓解机体炎症程度。提示ChAT/α7nAChR/NF-κB途径在二妙散对RA的治疗中起关键作用。二妙散抑制 CIA-FLS 增殖、迁移和炎症因子表达，可能通过抑制NF-κB信号通路的活化及炎症因子的生成，进而减轻 CIA-FLS 的增殖和炎症水平；汉黄芩素可有效抑制RA- FLS的增殖、迁移和侵袭，减轻细胞的炎症反应，且这些作用可能与胆碱能抗炎通路的激活有关，提示汉黄芩素可能是一种有效的RA治疗药物。