枯草芽孢杆菌细胞壁组分调控IPEC-J2细胞抗菌肽表达及其信号转导机理

Aim at lack of alternative antibiotics to effectively control intestinal infectious diseases, antimicrobial peptides, probiotics as well as immune stimulation are combined to investigate 1) the cell components of Bacillus subtilis expressing exogenous antimicrobial peptides regulate antimicrobial peptides expression of porcine intestinal epithelial cell IPEC-J2 and its mechanism, trying to ascertain new evidence on probiotic cell improving animal immunity. 2）Using real-time quantitative PCR analyze the relationship between dose and time-dependent of Bacillus subtilis cell wall active components regulation antimicrobial peptide expression. 3）Explore possible ways which regulate the expression of antimicrobial peptides by gene silencing and block or activation of receptor and related molecular biology techniques. 4）By luciferase reporter system, Western blot, and p65 nuclear translocation, studying the relationship of NF-кB signal transduction pathways, anti-inflammatory and pro-inflammatory cytokines with expression of antimicrobial peptides. This study provide theoretical foundation of molecular level to re-examine and establish anti-infection patterns and feeding system. It is important scientific significance for the use of human probiotics.

针对有效控制肠道感染性疾病的抗生素替代产品缺乏问题，本项目将益生菌、抗菌肽和激发机体免疫力三者有机结合，研究发酵表达外源抗菌肽的益生菌细胞壁活性成分调控猪小肠上皮IPEC-J2细胞抗菌肽表达及其机理。首先采用实时荧光定量PCR研究枯草芽孢杆菌细胞壁活性组分对抗菌肽表达调控的剂量和时间依赖性关系；再通过基因沉默、受体阻断或激活以及相关分子生物学技术探讨介导抗菌肽表达调控的可能途径；通过荧光素酶报告系统、Western blot 、激光共聚焦等手段研究NF-κB信号转导途径以及抗炎或促炎因子与抗菌肽表达的关系。本项目力图探明益生菌细胞提高动物机体免疫力的全新佐证，为重新审视和建立抗感染模式和饲料饲喂制度提供分子水平的依据，也为人类益生菌制剂的使用提供理论参考。

抗菌肽（AMPs），是先天免疫系统的重要组成部分，具有直接抗菌和免疫调节活性。通过日粮添加物质调控机体内源抗菌肽表达是一种抵抗病原菌感染的非抗生素方法。本研究从益生菌、益生菌细胞壁成分和益生菌代谢产物三个角度出发，选用枯草芽孢杆菌（WB800N）及其细胞壁成分肽聚糖（PGN）、磷壁酸（LTA）以及益生菌（丁酸梭菌）最终代谢产物丁酸的衍生物丁酸钠（NaB）作为研究对象，探索其对猪细胞抗菌肽和炎症因子表达调控的机理。研究内容和结果如下：（1）通过体外模型，检测猪肠细胞（IPEC J2）和猪肾细胞（PK-15）中内源抗菌肽mRNA的表达水平。结果发现，抗菌肽种类及含量根据组织分布不同而有所差异，在两种细胞中，猪源抗菌肽均有不同程度的表达，相对于IPEC J2 细胞来说，PK-15细胞内源抗菌肽的种类和含量都更多。（2）检测枯草芽孢杆菌及其细胞壁成分调控抗菌肽表达的时间和浓度依赖关系。首先利用枯草芽孢杆菌及其细胞壁成分肽聚糖、磷壁酸刺激IPEC J2和PK-15细胞，以确定枯草芽孢杆菌及其细胞壁成分不同培养时间状况下抗菌肽的表达变化情况。结果显示，枯草芽孢杆菌及其细胞壁成分WB800N、PGN和LTA具有较强的时间依赖效应，在短时间（6h）内三者能提高猪防御素pBD3的表达量，而在较长时间（24h）时，pBD3的表达量降低。（3）进一步研究发现PGN和LTA显著上调TLR2表达；WB800N显著上调TLR4的表达，这表明枯草芽孢杆菌及其细胞壁成分可能通过NF-κB的旁路途径调控抗菌肽基因表达。（4）NaB亦能诱导IPEC J2细胞中抗菌肽基因pBD3和pEP2C的表达，并通过HDAC抑制、TLR识别、NF-κB信号转导等复杂的信号转导机制调控猪源抗菌肽基因的表达。NaB能上调PK-15细胞中内源抗菌肽基因的表达，包括猪β-防御素3（pBD3）、附睾蛋白2剪接变体C（pEP2C）、pBD128、pBD123和pBD115，降低促炎因子IL-1α、IL-6产生，增加IL-18水平，具有免疫调节作用，本研究阐释了益生菌、益生菌细胞壁成分和益生菌代谢产物对猪内源抗菌肽表达调控的分子机制，为营养调控技术减少饲用抗生素的使用提供新的思路和理论依据。