枯草芽孢杆菌代谢组分协同降解赭曲霉毒素A的机理

Ochratoxin A (OTA) is a kind of mycotoxin, widely distributed in the grain and other agricultural products. In this item, mechanism on Bacillus subtilis CW14 which has the ability to degrade OTA（about 99%）will be studied. Maybe not a single component of CW14 contribute to degradation according to our preliminary experiment. Firstly, B. subtilis CW14 was fermented and protein/ peptide were purified. Then, we will study the degradation efficiency of Ochratoxin A by metabolic components(single and complex) of CW14. Validation of synergy degradation should include a process simulation test using CW14 medium..In a word, the research will hope to explore the synergy mechanism of OTA detoxification, not only detoxifying enzymes.

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是一种真菌毒素，广泛分布于粮食及其他农副产品中。前期研究发现枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CW14的发酵液具有99%脱除OTA的能力。而且实验表明初步分离的不同代谢组分，在降解OTA过程中都有一定作用。本项目拟分步纯化菌株发酵液中的蛋白和肽类物质，同时进行生物信息学分析其相关的功能基因序列，表达脱毒蛋白/合成相关肽类，对纯化或表达的蛋白/肽进行生物学性质验证（获得功能蛋白/肽）；在此基础上体外测试蛋白/肽单独降解OTA效果（单一成分脱除OTA作用）；其后模拟微生物发酵液条件，探索CW14降解OTA的蛋白、肽和小分子物质的协同作用方式，找寻关键作用因子（协同降解研究）。为前期研究过程中的现象、总结的一系列问题，用科学的数据探究合理的解释。

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是一种广泛分布于粮食及其他农副产品中的真菌毒素，相关的微生物脱毒机制一直是研究热点。本项目采用自有的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CW14作为研究对象，揭示其99%脱除OTA能力的根本原因。首先通过实验再次确认CW14菌株以及不同分子量的发酵液都可以消减OTA的现象，依据CW14对OTA吸附和降解的消解方式以及功能蛋白质的作用模式，提出了该菌株消减OTA的“菌-酶-肽”协同作用假说，本项目支持完成该假说的验证。通过离心分离菌体和灭活实验，明确菌体具有吸附脱除OTA的效果，发酵上清液采用分级分离并验证活性，明确CW14菌株发酵上清液中具有OTA消减作用的主要物质是酶和小分子肽。之后一方面对酶成分的脱毒机制进行研究，以牛羧肽酶（CPA）为阳性对照，通过HPLC-FD和TLC方法检测CW14菌株发酵液酶组分的OTA消减能力以及功能酶理化性质；同时应用生物信息学技术挖掘CW14核基因组潜在的OTA脱毒酶基因，采用异源表达方式获得目标蛋白，验证脱毒活性后得到2个具有OTA降解作用的羧肽酶，并检测到降解产物是OTα。另一方面，加热除去CW14发酵上清液的酶成分，并采用阴离子交换层析和凝胶排阻色谱层析分离纯化发酵上清液中的小分子肽，经质谱鉴定后获得具有OTA消减作用的肽类物质。以上研究解释CW14脱除OTA的物质基础。为更好的丰富“菌-酶-肽”作用的应用价值，拓展研究还包括Caco-2细胞模型评价CW14菌株的肠道保护功能；采用理性改造手段提高OTA脱毒酶的酸碱稳定性；探索群体感应淬灭对OTA脱毒的影响等，这些研究均可为CW14菌株和OTA脱毒酶的应用提供基础数据支撑。本项目从科学上解释CW14菌株消解OTA的综合机制，同时从应用上为制备“菌酶肽合剂”消减粮食和饲料中的OTA的构想提供理论支持。