树突状细胞和调节性T细胞共同介导的乳酸菌抗结肠炎作用免疫机制研究

乳酸菌作为益生菌，在防治炎症性肠病（IBD）和保障人类健康方面具有重要的生理作用和潜在应用价值，但其如何调解机体免疫系统的机制尚不明确。鉴于此，本研究应用已经筛选的具有抗炎活性的乳酸菌干预正常小鼠，采用免疫磁珠法分离肠系膜淋巴结中CD11c+树突状细胞应用流式细胞术、荧光定量PCR等方法研究乳酸菌诱导DCs亚群的分化与发育以及分化的DCs亚群对Tregs发育的影响；应用乳酸菌干预三硝基苯磺酸诱导的小鼠结肠炎模型和CD4+CD45RBhighT细胞过继性转入SCID小鼠诱导的慢性结肠炎模型，采用流式细胞术、免疫荧光技术等研究Tregs在小鼠结肠炎模型中的免疫调节作用，阐明乳酸菌调节免疫系统发挥抗炎效应的分子作用机制，为进一步开发乳酸菌作为免疫调节剂预防IBD奠定理论基础。

本研究获得具有抗炎活性的混合乳酸菌Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 +Lactobacillus rhamnosus GG ATCC 53103+Lactobacillus plantarum A，其中，ATCC4356、ATCC 53103购自美国模式培养物研究所，L.p A由本实验室从市售酸奶中分离得到，经过16s rDNA技术进行鉴定后，用于实验。体外筛选通过检测MLN与乳酸菌共培养后Foxp3、IL-10、IL-12等的表达，进行筛选；体内筛选通过检测不同组合的乳酸菌干预小鼠后MLN中CD4+CD25+Foxp3+Treg、IL-10、IL-12的表达进行筛选。另一方面，将筛选出的混合乳酸菌干预小鼠21d后，检测小鼠MLN和脾脏中CD11c+CD11b+CD8α+DC、CD11c+B220+CD8α+DC、CD80/CD86、CD40、MHC-II等技术指标，明确乳酸菌对体内树突状细胞亚群的分化、发育的作用；应用MACS分选乳酸菌作用后小鼠MLN中的DC，与MACS分选出的正常Balb/C小鼠的CD4+T细胞共培养，检测Th1型（IFN-γ）、Th2型（IL-4）、Th17（IL-17）型细胞因子，评价乳酸菌诱导的DC对Th细胞的极化作用，评价乳酸菌诱导的DC使得Th细胞向哪个方向极化。最后，将筛选出的混合乳酸菌干预小鼠21d后，检测CD4+CD25+Foxp3+Treg及相关因子，再用柠檬酸杆菌（Citrobacter rodentium ATCC 51459）干预乳酸菌作用后的小鼠，并检测CD4+CD25+Foxp3+Treg，IL-17、IFN-γ、TNF等相关细胞因子，截取小鼠远端结肠进行组织病理学检测，从分子水平和细胞水平阐明Treg对宿主免疫系统产生抗炎作用的机制。