乳酸菌在不同种属动物肠相关淋巴组织B细胞分化发育中的作用及分子免疫机制研究

The function and molecular immunologic mechanisms of normal intestinal flora has been considered to be a common research focus worldwide and the gut associated lymphocytes tissue (GALT) could be the prime immune organs for the origin, differentiation and development of B cells. To prove this hypothesis, we have demonstrated that the administration of Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) could stimulate the development of Pro-B cells in GALT of BALB/c mice, in addition, increased expressions of MHC-Ⅱ、CD40 and CD80 were also observed. In this study, we will focus on the effects of LGG and the mixture with other probiotics on animals with different GALT structures, including piglet, calf and young rabbit. The development of B cells, rearrangement of VDJ fragments, multiplex of antibody pools, subtypes of immunoglobulin and distribution of B cells will be determined by FACS, transcriptomics and transgenic animal models. The results will clarify the dependent mechanisms of development of B cells from different species animals on lactic acid bacteria, providing scientific basis for studies of animal micro ecology and immunological development.

肠道正常菌群的功能及其分子免疫机制已经成为免疫学界研究的热点。已有研究发现有些动物B细胞的发育要依赖肠道菌群，这表明动物肠道相关淋巴组织（GALT）可能是B淋巴细胞起源、分化、发育的场所，即初级免疫器官。为了证实该科学假说，课题组在前期预实验发现鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）能刺激BALB/c小鼠GALT中早期祖B细胞的分化发育，并上调B细胞MHC-Ⅱ、CD40和CD80的表达水平。本项目拟选择GALT组织结构不同种属动物（仔猪、犊牛和仔兔），饲喂鼠李糖乳杆菌和益生菌混合物，利用流式细胞术、转录组学和转基因动物模型等手段，对GALT中B细胞分化发育、对VDJ片段的重排、抗体库多样性、Ig分型、B细胞分布等测定。本研究将为阐明乳酸菌在不同种属动物B细胞分化发育中的免疫学机制奠定基础，为动物微生态学与免疫发育学的发展提供理论依据。

肠道正常菌群的功能及其分子免疫机制已经成为免疫学界研究的热点。已有研究发现有些动物B细胞的发育要依赖肠道菌群，这表明动物肠道相关淋巴组织（GALT）可能是B淋巴细胞起源、分化、发育的场所，即初级免疫器官。为了证实该科学假说，课题组在前期预实验发现鼠李糖乳杆菌（LGG）能刺激BALB/c小鼠GALT中早期祖B细胞的分化发育，并上调B细胞MHC-Ⅱ、CD40和CD80的表达水平。本项目选择仔猪饲喂鼠李糖乳杆菌，利用流式细胞术、转录组学等技术，对GALT中B细胞分化发育、对VDJ片段的重排、抗体库多样性、Ig分型、B细胞分布等测定。本项目构建重组质粒pET-28a-pRAG2，接着把重组质粒转化到大肠杆菌中，使之表达RAG2蛋白，并将蛋白命名为pRAG2，通过亲和层析法纯化获得pRAG2，并免疫兔制备高免血清获取兔抗pRAG2多克隆抗体，并通过western blot以及免疫荧光验证抗体能够有效的识别猪RAG2蛋白。其次，通过流式细胞术分析发现，在仔猪骨髓和小肠固有层中存在MHC-II+CD45RC+CD172a+RAG2+早期B细胞，而在脾脏、肠系膜淋巴结以及PP结中却检测不到。接下来又通过流式细胞术分析发现，仔猪肠道固有层中MHC-II+CD45RC+CD172a+RAG2+早期B细胞的百分比随着日龄而增加，但在52天时到高峰，而骨髓中MHC-II+CD45RC+CD172a+RAG2+早期B细胞百分比一直在增加。再次，通过灌胃的方式用1×1010 CFU LGG干预断奶仔猪连续15天，然后通过流式细胞术分析发现，LGG能够促进肠道中的早期B细胞向更成熟的阶段发育。此外，利用流式细胞术从空肠固有层中分选出早期B细胞进行转录组测序以及实时荧光定量PCR分析发现，LGG能够上调氧化磷酸化以及下调细胞周期代谢通路，并且能够上调转录因子FOXO1，RAG1和RAG2的表达，从而进一步证实LGG可以促进早期B细胞发育。此外，候选人还发现LGG分泌的p40蛋白可以激活EGFR/AKT/NF-κB信号通路，诱导猪肠上皮细胞分泌增殖诱导配体，从而促进B细胞分泌IgA。最后，研究发现与p40相互作用的IPEC-J2细胞的潜在膜受体。通过研究仔猪B细胞分化发育对LGG依赖的免疫机制，揭示仔猪肠道固有层是B细胞发育的初级淋巴组织，为动物微生态与免疫发育学的发展提供科学依据。