人肠道病毒71型入侵神经系统的细胞突触途径的研究

Elucidate the pathogenesis of neurological complications caused by Human Enterovirus 71 (EV71) will provide guide on the prevention and treatment of hand, foot and mouth diseases. Our previous results showed that: EV71 replication was detected in microglial cells and Neurons of the central nervous tissue as well as in the macrophage and granulocytes of other tissues. Meanwhile, the level of nerve tissue associated protein GDN and NID1 were enhanced in the serum of patients with severe complications. To elucidate the relationship between cell, proteins and the process of virus invasion on nerve system, and then clarify the pathway of virus enter nerve system, we will develop the animal model infected with fluorescent-labeled virus, and then observe and track the viable virus in vivo by fluorescence con focal or two-photon fluorescence imaging to identify the organs, tissues and cells associated with the process of invasion on nerve tissues. We will focus on the role of targeted cell in this process, and then identify the critical proteins (GDN and NID1 etc) participated in this process and their interaction mechanism by co-immunoprecipitation and molecular biology techniques. These results will promote the interpretation of pathogenesis of neurologic complications, and provide new targets for the development of biological and chemical drugs, and provide a new theoretical basis and experimental basis for practicable disease prevention.

阐明EV71引起神经并发症的发病机理，能指导该病预防和治疗。课题组前期研究表明，中枢神经组织的小胶质细胞和神经元以及其他组织器官中的巨噬细胞、粒细胞中都存在EV71复制；此外，重症患者血清中还发现神经组织相关蛋白GDN和NID1的水平显著升高。为揭示所发现的细胞和蛋白与病毒侵入神经组织过程之间关系，阐明病毒入侵神经组织途径，本研究通过建立荧光标记活病毒感染动物模型，采用荧光共聚焦或双光子荧光显微成像技术，对活体内的病毒观察、追踪，揭示病毒在侵入神经系统过程中所经历的器官、组织和细胞，着重研究病毒靶细胞在该过程中的作用，并应用免疫共沉淀和分子生物学等技术手段鉴定该过程中涉及的蛋白分子（GDN和NID1等）及其相互作用机制，为从根本上诠释神经并发症的发病机理迈出重要的一步。该研究可为新型生物和化学防治药物的研发提供崭新的、针对性强的作用靶点，为该疾病的合理预防提供新的理论依据和实验基础。

本研究目的阐明EV71发病机理以指导手足口病的预防和治疗。本研究选取具有高致病性的EV71病毒株（MP-10)，利用基因重组的方法构建了表达报告基因的（EGFP）的EV71病毒（EGFP-MP-10)，将构建好的重组病毒cDNA分子克隆和T7转录酶表达载体转染RD细胞。电镜观察可见规则排列的病毒粒子，Western Blot检测可见特异性病毒VP1蛋白条带，获得了具有感染性的重组病毒株，同时利用重组病毒株建立小鼠模型感染后监测不同组织内病毒载量，为EV71致病机制的研究奠定基础。筛选了具有高致病性的EV71病毒株（GD10-12)，建立小鼠适应株及动物模型，分析感染后不同时间点不同组织内病毒的分布及病理变化，不同代次病毒株的全基因组序列分析关键突变位点，明确了EV71病毒适应株在BALB/c小鼠通过不同感染途径感染后病毒在小鼠体重分布的时序性，为了解和探索EV71感染机体的入侵途径提供参考。利用RNA组学分析，证实IL-22是EV71感染过程中的关键蛋白分子，并利用动物模型证实了IL-22中和抗体明显减轻EV71感染小鼠组织的验证损伤并明显减低死亡率，明确IL-22中和抗体对EV71感染的保护作用，为EV71临床治疗用药提供参考；此外，课题组前期研究发现重症患者血清中还发现神经组织相关蛋白TREE、GDN和NID1的水平显著升高，本项目利用质谱多反应监测技术（MEM）验证了6种较稳定的关键蛋白分子，验证证实NID1和TREE的升高与重症EV71感染相关，同时利用胶质细胞验证，发现胶质细胞是EV71感染神经组织的关键细胞，且胶质细胞内TREE、GDN和NID1的表达明显升高，进一步说明胶质细胞相关蛋白在重症感染中的作用。该研究为药物的研发提供崭新的、针对性强的作用靶点，为该疾病的合理预防提供新的理论依据和实验基础。