肠道病毒71型神经系统致病机制的研究

肠道病毒71型主要感染婴幼儿，最常见的两大临床症状是手足口病和中枢神经系统感染，已成为目前全球范围内取代脊灰的最重要的中枢神经毒性病原。自1974年首次报道后，EV71已在世界范围引起十多次暴发与流行，但对该病毒的研究近几年才得到重视，现有研究资料多为分子流行病学研究，另有以VP1为靶蛋白的新型疫苗研究。EV71感染导致危害最严重的是神经系统感染，即使是最轻微的神经系统感染，也可能导致永久的后遗症。因此弄清EV71导致中枢神经系统感染的机制特别重要。本研究拟于流行期间，分离不同表型的EV71毒株，进行其分子流行病学的研究，并通过分析表型与序列的关系，筛选与中枢神经系统症状有关的毒力决定簇候选基因，并通过构建感染性cDNA克隆，从分子水平改造病毒，确定与神经毒力有关的基因。其意义在于通过毒力决定簇解释EV71的中枢神经系统致病机制，有助于以筛选出的毒力决定簇为靶点设计治疗药物和制定预防措施。

在本课题的研究中，共获得98株EV71分离株；根据鉴定结果，回顾分析病毒分离情况，发现最终鉴定为EV71的毒株，尤其是出现严重神经系统累及的患儿标本，接种细胞后出现病变的时间越短，病变越明显。分析原因可能是基因组中存在着与神经系统感染有关的关键位点突变。对6株分离鉴定的EV71分离株进行全序列扩增、测序和分子流行病学分析，并对部分毒株进行部分序列测定和分子流行病学分析，包括5′UTR区序列分析、VP1区序列分析、3D区序列分析。结果表明，本研究所获得的EV71分离株均属于C4亚型，其3D区与CoxA16 原型株G-10的系统发生关系较近，与EV71原型株BrCr/70的系统发生关系较远，表明本研究中获得的EV71分离株可能为EV71与CoxA 16的重组毒株（3D区重组）。通过序列分析共筛选出12个可能与毒力有关的候选位点，主要位于5′UTR区和3D蛋白编码区，病毒的毒力可能是多个位点共同起作用的结果。对5′UTR区和3′UTR区的二级结构进行预测，发现重症株5′UTR区的二级结构基本相同，而轻症株5′UTR区的二级结构则各不相同，提示毒力改变可能与5′UTR区二级结构的改变，进而影响了病毒的复制有关。采用EV71轻症分离株和重症分离株分别感染1日龄和7日龄ICR乳鼠，结果表明，重症分离株感染的乳鼠表现出明显的症状，包括竖毛、弓背、消瘦、肢体麻痹，轻症分离株感染的乳鼠症状明显较轻，对照组乳鼠无明显变化，各组织病理检查发现，重症分离株感染的乳鼠各脏器均表现出明显的病理变化，轻症分离株感染的乳鼠病理变化较轻，对照组未观察到病理变化。实时荧光定量PCR检测结果表明，重症分离株在各组织中的病毒载量均高于轻症分离株，肌肉组织中病毒载量最高。乳鼠实验结果表明，不同毒力表型的分离株在ICR乳鼠感染中表现出与临床表现相应的致病能力，并且表现出不同的复制能力。EV71的复制能力可能是感染后引起不同临床表型的主要原因，而复制能力的改变可能取决于与复制有关的区域关键氨基酸突变（本研究筛选出12个候选位点），这些位点可能是单独起作用，也可能是多位点共同作用。这在EV71感染导致严重神经系统累及的机制研究中属首次明确提出，具有重要意义。