知母皂苷A-III抗人肠道病毒71型研究

Human enterovirus 71 (EV71) can cause hand, foot and mouth disease (HFMD) in infants and children and poses a serious threat to their health. However, there is currently no specific drug for the treatment of EV71 infection. We previously found the extracts and one bioactive component, timosaponin A-III (TAIII), from Anemarrhenae rhizoma showed significant anti-EV71 activity. In this programme, we would like to determine the anti-EV71 activity of TAIII in vitro and in vivo by measuring the inhibitory effects of TAIII against EV71 in cytopathic effect, plaque formation, and progeny virus yield. We would also explore the anti-EV71 mechanism of TAIII by testing the action mode, dosage, and time of addition for TAIII, examining the effect of TAIII on viral gene transcription and protein expression, investigating the cellular autophagic and apoptotic signaling pathways, and detecting the cytokines and chemokines in EV71 infected cells. Therefore, we might provide valuable information to explain the mechanism of TAIII against EV71 infection and promote the antiviral research of traditional Chinese medicine.

人肠道病毒71型（EV71）能引起小儿手足口病，严重危害婴幼儿健康。目前尚无治疗EV71感染的有效药物。我们的前期研究首次发现中药知母提取物及其活性成分知母皂苷A-III（timosaponin A-III，TAIII）具有显著的抗EV71活性。本项目将通过体外测定TAIII抑制EV71引起的细胞病变、空斑形成和子代病毒产生等效应和体内药效实验，进一步确证TAIII抗EV71活性；通过测定TAIII抗EV71的作用模式、剂量效应和时间效应，以及TAIII对EV71感染细胞中病毒基因转录和蛋白表达、细胞自噬和/或凋亡信号通路相关蛋白、细胞因子和炎症因子的影响等药效学研究，阐明其抗病毒作用机制。本研究有望阐明知母及其活性成分抗EV71的机制，为中药抗病毒药物研究提供理论依据。

知母皂苷A-III (timosaponin A-III, TAIII)是中药知母的一个重要活性成分，具有心血管系统药理、抗肿瘤、降血糖、抗病毒等作用，能够改善记忆力和学习能力。本项目在发现TAIII能够抑制人肠道病毒71型(human enterovirus 71, EV71)感染Vero和RD细胞形成的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)的基础上，进一步开展了TAIII抗EV71的体内、外活性和体外机制研究。.体外活性实验表明：TAIII在Vero和RD细胞上的半数细胞毒性浓度低，抑制EV71引起的细胞病变的半数抑制浓度也低，从而造成选择指数很低，实验可选用的TAIII浓度范围比较局限；此外，TAIII对EV71感染Vero细胞形成的空斑有明显抑制作用。.体内活性实验表明：TAIII腹腔注射对1日龄ICR乳鼠有一定肝脏毒性，对EV71感染1日龄乳鼠不但没有明显的保护作用，还加剧了病程发展；口服饲喂对7日龄ICR乳鼠没有明显的毒副作用，对EV71感染7日龄ICR乳鼠没有明显的保护作用，尽管发病率稍微降低，但病程发展却加剧。.体外机制研究发现：TAIII对EV71无直接杀灭作用，治疗模式下明显抑制EV71感染Vero细胞的空斑形成，对EV71感染Vero细胞中EV71 RNA水平有一定的抑制作用，对VP1蛋白表达只有微弱的抑制作用，对子代病毒的产生没有抑制作用；TAIII仅对EV71低感染复数(≤0.5)感染RD细胞引起的CPE具有一定的抑制作用，但对感染细胞中病毒衣壳蛋白VP1的表达没有明显的抑制作用；TAIII可引起RD细胞蛋白质组明显变化，包括208个细胞组分蛋白、45个分子功能蛋白、101个生物过程蛋白，同时包括嗅觉转导和趋化因子信号通路等在内的82条细胞信号通路的蛋白表达发生变化，这暗示TAIII可能通过调节细胞信号通路影响细胞从而间接发挥抗EV71作用。.综上所述，本研究在Vero和RD细胞上确证了TAIII体外抗EV71活性，但未能在ICR乳鼠中发现TAIII体内抗EV71活性。TAIII体外抗EV71机制的初步探索暗示着TAIII可能通过调节细胞信号通路影响细胞来间接发挥抗EV71作用，而不是直接发挥抗EV71作用。这为从中药中开发抗EV71药物提供了一些思路。