CD47调节红细胞吞噬现象在脑出血后脑损伤中的作用机制研究

Intracerebral hemorrhage(ICH) is known for its high incidence. Brain injury is an important factor for the poor outcome. Erythrocyte and its lytic substances are the most neurotoxic factors after ICH which results in secondary brain injury. Previous study demonstrated that microglia were polarized to different phenotypes of macrophages to clear the erythrocytes in the hematoma after ICH. CD47, which expresses on the erythrocyte surface, is an important factor regulating the erythrophagocytosis. It prevents the erythrophagocytosis by binding SIRPα on the surface of macrophage, releasing "do not eat me" signal. Thus, we hypothsize that knocking out CD47 on erythrocyte can promote the erythrocyte clearance, decrease the release of neurotoxic substance and attenuate brain injury after ICH. In the current study, we establish WT/CD47 knock-out blood donated ICH model in nude mice to identify the relationship among microphage polarization, hematoma clearence and acute or chronic brain injury after ICH. In addition, we also evaluate the brain injury after macrophage depletion. Finally, we will elucidate the role of CD47 induced erythrophagocytosis in the brain injury after intracerebral hemorrhage, which may be a new therapeutic target for ICH.

脑出血发病率极高，脑损伤是其不良预后的重要原因。红细胞及其裂解产物是引起脑出血后继发性脑损伤最重要的神经毒性物质。前期研究证明，脑出血后大量被激活的小胶质细胞可极化为不同类型的巨噬细胞并执行清除红细胞的功能。红细胞表面的CD47是调节巨噬细胞吞噬红细胞现象的重要环节，CD47向巨噬细胞表面的SIRPα释放“勿要吞我”信号，阻止巨噬细胞将其吞噬。由此推断，敲除红细胞表面CD47分子可加速脑出血后红细胞的清除，减少红细胞裂解物质释放，减轻脑损伤。本课题拟利用WT小鼠及CD47敲除小鼠的血液作为供体血，建立裸鼠脑出血模型，观察CD47敲除对巨噬细胞极化及红细胞清除过程的影响，分析其与脑出血后急慢性远期脑损伤的关系；进一步通过清除巨噬细胞观察对脑出血后急慢性脑损伤的影响，最终阐明CD47调节红细胞吞噬现象在脑出血后脑损伤程度发生关系的病理生理机制，为脑出血治疗提供新靶点。

目的：CD47是一类广泛存在各种组织中的膜糖蛋白分子。红细胞表面存在大量CD47，后者向巨噬细胞表面的SIRPα释放“勿要吞我(do not eat me)”信号，继而阻止巨噬细胞将其吞噬。通过干预CD47-SIRPα通路可促进巨噬细胞对红细胞的吞噬，继而对影响脑出血后的铁代谢及急慢性脑损伤。本部分实验利用普通野生型小鼠(Wild type )WT小鼠及CD47-/-小鼠的血液作为供体血，制作裸鼠脑出血模型，观察阻断CD47-SIRPα信号通路是否可造成巨噬细胞极化趋势产生变化，并且影响脑出血预后。. 方法：首先，向裸鼠基底节区注入30μl生理盐水、野生型(Wild type, WT)小鼠血或CD47敲除型(CD47 Knockout, CD47-/-)小鼠血，观察各组间小胶质细胞/巨噬细胞激活情况及不同类型巨噬细胞在不同时间点的分布特征及表达特征，同时检测各组在不同时间脑水肿、T2*病变体积、神经元死亡、神经功能障碍及脑萎缩等。而后，将生理盐水中混入5μl氯磷酸盐脂质体(Clodronate Liposome, CL)，CD47-/-小鼠血中混入5μl氯磷酸盐脂质体或空白脂质体(Control Liposome)，并注入裸鼠右侧基底节区，观察CL对CD206及CD86表达的影响并检测急性期不同时间点脑水肿、T2*病变体积的变化。. 结果：两种不同类型血注射的裸鼠脑出血后3天均可见红细胞被吞噬现象，CD47-/-血注射裸鼠基底节区后脑内T2*病变的清除速率高于WT小鼠血注射组；注射侧半球3天时脑水肿及神经功能障碍轻于WT小鼠血注射组。术后28天，CD47-/-血注射组同侧脑室扩张率及神经元死亡率小于WT组。术后3天，CD47-/-血注射组小胶质细胞激活显著高于WT组，血肿区周围M1巨噬细胞表达低于WT组，M2巨噬细胞表达高于WT组。同时可见血肿区周围HO-1及Ferrtin表达高于WT组。CL延缓了CD47-/-血注射裸鼠脑内T2*病变的清除，加重CD47-/-血注射裸鼠的脑水肿。同时发现CL抑制脑内CD47-/-血注射后CD206的高表达，但对CD86无显著影响。. 结论：敲除脑出血后血肿内红细胞表面的CD47分子可加速血肿的清除，并减轻脑出血后的急慢性脑损伤。这一结论提示提高红细胞吞噬效率可能是治疗脑出血的一个新思路。