丝状真菌组成性毒素的解毒机制研究

Constitutive toxins (CT) are the important defense substances for filamentous fungi against fungivores. Previous work showed that CT produced by Neurospora crassa is the product of a polyketide synthase gene (pks-5). This pks-5 forms a gene cluster together with other 9 genes including those encoding cytochrome pigment 450 (CYP450), major facilitator superfamily (MFS) efflux pumps, sulfate transporter (SULT) and transcription factor (TF). The mechanisms of self-detoxification to CT by Neurospora crassa, however, have not yet been clarified. Utilizing Neurospora crassa as the research material and Aspergillus nidulans as the receptor of heterologous gene expression, this project aims to conduct systematically the following research: 1) elucidating the CT structure by heterologous expression; 2) identifying the function of genes in CTNC gene cluster by gene knock-out methodologies and confirming these gene functions in Aspergillus nidulans by gene knock-out and gene cluster cloning technologies, further illuminating CT biosynthesis, its structure modification and the regulation of efflux pumping of CT in order to uncover the self-detoxification mechanisms of filamentous fungi on molecular basis, provide new theory for filamentous fungi to resist environmental stress and offer a valuable hint for searching new pathways for detoxifying toxic environmental substances and new protocols for environmental ecological remediation.

组成性毒素是丝状真菌抵御敌害生物吞食的重要防御性物质。前期研究发现粗糙脉孢菌组成性毒素为—聚酮合成酶基因(pks-5)表达产物。该pks-5与编码细胞色素450、转运蛋白外排泵、硫酸根转运蛋白及转录因子等9个基因形成基因簇，但丝状真菌存在何种解毒机制避免组成性毒素对自身细胞伤害尚无相关信息资料。本项目拟以模式丝状真菌粗糙脉孢菌为材料，遗传改造的构巢曲霉为外源基因受体，系统开展以下研究：1)采用异源基因表达技术阐明组成性毒素化学结构；2)借助基因敲除和基因簇克隆技术研究组成性毒素合成基因簇的基因功能并以构巢曲霉进行验证，系统阐述丝状真菌组成性毒素的生物合成、结构修饰、转运等调控作用，从分子水平揭示丝状真菌组成性毒素的自身解毒机制，为丝状真菌抵御环境胁迫提供新的理论依据，为探索环境毒素的解毒途径及生态修复的新方法提供有价值的参考。

丝状真菌在与环境相互作用过程中，形成了独特的应对环境胁迫的机制。在以模式真菌—粗糙脉孢菌为实验材料的研究过程中，我们发现粗糙脉孢菌通过合成组成性毒素抵御昆虫吞食，并通过对毒素的修饰或外排等机制避免对自身造成伤害。利用antiSMASH软件分析发现，粗糙脉孢菌中合成组成性毒素的基因聚酮合酶（PKS5）和编码短链脱氢酶还原酶（DH）、转运蛋白（MFS-1，MFS-2）、细胞色素450（CYP-1，CYP450-2）、转录因子（TF）、硫酸根转运蛋白（SULT）等9个基因共同构成了组成性毒素合成基因簇。研究中确定了PKS5合成的组成性毒素的化学结构。CYP450是真菌体内含量最多、功能最多的活性蛋白酶，能够降解外源毒物以及自身有毒次级代谢产物，CYP450敲除菌株（∆CYP450）菌丝体生长发育不发达。MFS能够将菌体产生的毒素排到细胞外发生作用，MFS敲除菌株（∆MFS）同样表现出菌丝体生长发育不发达的表型，此外该突变菌株不能形成分生孢子。SULT将硫酸根转运到胞内发生同化反应，合成半胱氨酸，参与电位的调节，SULT敲除菌株（∆SULT）在生长过程中亦不能形成分生孢子。TF在细胞基因表达过程中起着双重调控作用：对丝状真菌次级代谢产物进行调节，并对不利于自身的外来信号传导作出反应。粗糙脉孢菌在遭受物理或生物胁迫过程中，转录因子起到了关键的调控作用：转录因子高表达菌株（OE::TF）中与毒素合成相关基因能在受到胁迫时快速高效转录表达，并合成大量的毒素，而转录因子缺失菌株不能做出此反应。在研究过程中我们还发现基因PKS6的产物在抵御昆虫吞食的过程中也起着关键的作用，并且PKS5和PKS6的产物在子囊壳中的积累水平最高。两个PKS基因在构巢曲霉（LO8030）的异源表达菌株的次级代谢产物对大蜡螟和果蝇均表现出较强的毒性。本项目以粗糙脉孢菌为实验材料，在分子水平上揭示了丝状真菌组成毒素的合成和自身解毒的解毒机制，深入研究了丝状真菌与其他物种之间相互作用机制并探索了环境生态修复的新途径，为丝状真菌抵御环境胁迫提供了理论基础。