丝状真菌液体发酵形态控制的分子机制研究

丝状真菌由于强大和多样化的代谢能力，而被用于生产一系列具有重要社会和经济价值的代谢产物。在深层发酵体系中，丝状真菌常常由于菌体形态变化的多样性，而影响发酵液的流变特性和代谢产物合成，因此，菌体形态控制一直是工业微生物学家研究的难点和热点。本课题以米根霉乳酸生产菌R.oryzae NRRL 395为模式菌株，以形态代谢工程为研究手段，通过抑制性差减杂交（SSH）技术，筛选并解析引起菌体形态变化的差异表达基因，利用定向环境扰动技术调控形态发育关键基因的表达及对菌体形态的影响，在此基础上，结合外界环境扰动与碳代谢流迁移等综合分析，获得形态与代谢产物之间的关系，重构形态变化与代谢产物合成耦合的代谢网络模型，优化菌体形态以及碳代谢分配，达到控制菌体形态强化产物积累的目的。本课题的开展将为丝状真菌工业化生产提供技术平台，推动丝状真菌形态代谢工程的快速发展。

本课题以米根霉乳酸生产菌R.oryzae NRRL 395为模式菌株，以形态代谢工程为研究手段，利用分子生物学技术，筛选并解析引起菌体形态变化的差异表达基因，利用定向环境扰动技术调控形态发育关键基因的表达及对菌体形态的影响，在此基础上，结合外界环境扰动与碳代谢流迁移等综合分析，获得形态与代谢产物之间的关系，重构形态变化与代谢产物合成耦合的代谢网络模型，优化菌体形态以及碳代谢分配，强化目标产物合成途径，提高糖的转化率，最终实现乳酸的高效生产，主要研究内容如下：. 1) 筛选得到形态突变菌株R.oryzae LA-UN-1，该菌株培养易形成直径在1.0-1.4mm之间的球形；2) 构建了R.. oryzae 的乳酸代谢网络的数学模型，并对诱变菌株和出发菌株进行代谢流比对分析；3）利用分子生物学技术，对突变株和出发菌株引起菌体形态变化的差异表达基因进行初步的筛选和解析：a）运用蛋白质组学方法，系统分析了球状和丝状米根霉的蛋白表达谱，发现共有128个蛋白发生明显的变化，通过MALDI-TOF质谱技术成功鉴定了22个与丝状真菌的形态发生有关的蛋白；b）利用高通量的RNA-Seq测序技术对两种不同形态下的米根霉的mRNA进行深度测序考察基因的转录变化，共发现1438个在球状和丝状米根霉中发生转录差异的基因，其中在球状米根霉中转录上调的基因有814个，在丝状米根霉中转录上调的基因有624 个；c）进一步分析比对BROAD数据库中的米根霉基因组，筛选到了与米根霉形态发生密切相关的基因chitin synthase（chsB和csmA的同源基因），并通过Fussion PCR构建带有筛选标记的整合片段，并进行了丝状真菌的转化；4）探索了发酵阶段菌体生长形态对米根霉产乳酸的影响，量化分析了菌体直径、菌体密度两项指标对乳酸分泌的影响，半定量分析了菌球内部结构分析对菌体产酸的影响；5）建立了R.oryzae LA-UN-1高密度高通量持续发酵积累乳酸的工艺路线，在此条件下，其乳酸产量以及生产强度分别达到了156g/l和3.12g/l/h，分别较传统工艺提高了168%和150%； 6）探讨了废弃米根霉菌体的回收再利用的工艺，成功制备出新型的米根霉磁性生物吸附剂。