葛根素上调BDNF治疗血管性痴呆的机制研究

Our previous studies found that puerarin had a therapeutic effect on vascular dementia, and upregulated the expression of BDNF in nerve cells. It was also found that puerarin could play a protective role in ischemic brain injury by regulating intracellular calciumion concentration and reducing calciumion overload. Previous studies have shown that calcium-dependent MoCP2 protein phosphorylation is a key factor in the regulation of BDNF expression, and PI3K-Akt pathway is the main pathway of BDNF playing a neuroprotective role. For this reason, we make a assumption that puerarin acts on the cell membrane calcium channels, regulates calciumion concentration in nerve cells, induces MeCP2 phosphorylation, promotes MeCP2 to dissociate from the BDNF gene promoter, upregulates the expression of BDNF. The upregulated BDNF finally combines with TrkB, inhibiting apoptotic gene expression through the PI3K-Akt pathway, playing a part in neuroprotection and improving the prognosis of vascular dementia.This study was designed to observe the change of dementia indexs and regulatory molecule of BDNF expression before and after the puerarin intervention in the nerve cells and rat models by means of patch clamp technique, laser scanning confocal fluorescence imaging and molecular biology，verify that our hypothetical mechanism of puerarin increased BDNF treatment of vascular dementia，hope to improve the mechanism of puerarin treatment of vascular dementia, provide a theoretical basis for clinical treatment of puerarin of vascular dementia.

我们研究发现葛根素对血管性痴呆具有治疗作用，并上调BDNF的表达，还发现葛根素可以过调节细胞内钙离子浓度，对缺血性脑损伤发挥保护作用。前人研究表明钙依赖的MoCP2蛋白磷酸化是调控BDNF表达的关键因素，而BDNF主要通过PI3K-Akt通路发挥神经保护作用。由此我们提出假设：葛根素作用于细胞膜钙离子通道，调节细胞内钙离子浓度，诱导MeCP2磷酸化，促进MeCP2与BDNF基因启动子解离，从而上调BDNF表达，最终BDNF与TrkB结合，通过PI3K-Akt通路发挥神经保护作用，改善血管性痴呆的预后。本研究拟在神经细胞及大鼠模型上应用膜片钳、激光共聚焦荧光显像、分子生物学等实验手段观察葛根素干预前后痴呆指标和BDNF表达调控分子的变化，从细胞及活体动物两个层面来验证我们关于葛根素上调BDNF治疗血管性痴呆的机制假设，期望完善相关机制，为葛根素应用于临床治疗血管性痴呆提供理论依据。

背景：血管性痴呆是导致痴呆的第2位主要原因，因此预防及治疗VaD具有重要的经济和社会价值。目的：证明葛根素通过调节神经细胞内Ca2+浓度，促进Ca2+依赖的钙族蛋白磷酸化，上调BDNF表达，通过PI3K-AKT通路，对VaD发挥神经保护作用。实验方法：在体实验：采用改良的2-VO法制备VaD大鼠模型。Morris水迷宫检测大鼠的学习记忆能力，HE染色显微镜下观察海马区结构。流式细胞仪检测Ca2+浓度，免疫组化检测BDNF、MeCP2及磷酸化MeCP2表达，免疫荧光染色检测CaM、CaMKⅡ的阳性细胞数，ELISA法检测cAMP的含量，Western blot检测CaM、CaMKⅡ、BDNF、MeCP2及磷酸化MeCP2含量，RT-PCR检测CaM、CaMKII mRNA的表达。细胞实验：PC12细胞氧糖缺如建立血管性细胞模型。Western Blot检测CaM、CaMKⅡ、MECP2、BDNF及Akt蛋白表达。实验结果：在体实验：模型组Ca2+浓度最高，对照组最低。CaM在对照组中表达最低，模型组中最多，葛根素干预组介于两者之间。CaMKⅡ在模型组中表达与对照组相当，葛根素组明显升高。MeCP2 表达各组间无差别，磷酸化MeCP2 、BDNF以及cAMP在对照组中表达最低，葛根素组中表达最多。模型组和葛根素组CaM、CaMKⅡ mRNA的表达均有不同程度降低，但葛根素组的表达较模型组明显升高。细胞实验：CaM模型组中表达最高，葛根素组与对照组表达基本相当。CaMKⅡ在模型组中表达量与对照组基本相当，而葛根素组中表达明显升高。MeCP2在葛根素组中表达最高，模型组中表达量与对照组基本相当。BDNF在模型组表达量最低，葛根素干预组最高。P-AKT在对照组和痴呆模型组表达基本相当，在葛根素组中表达最多。结论：葛根素对VaD大鼠的神经保护作用，可能与减少急性期的CaM的释放，增加CaMKⅡ、p-MeCP2表达，减轻海马细胞钙离子超载所致损伤，促进慢性期Ca2+内流，上调CaM、CaMKⅡ mRNA的表达密切相关，提高CaM、CaMKⅡ蛋白分子的表达，诱导腺苷酸环化酶及鸟苷酸环化酶磷酸化进程，增强cAMP及cGMP的活性，提高BDNF含量，激活下游PI3K-AKT通路有关