EPO-TAT抗神经衰老过程中对Keap l-Nrf2通路的调控机制研究

新型EPO制剂EPO-TAT融合蛋白能高效通过血脑屏障，发挥EPO生物学效应。我们之前的研究发现EPO通过增强机体抗氧化能力，清除过量自由基，发挥抗神经衰老作用，但其机制尚不清楚。部分研究在缺血缺氧细胞模型上已经证实Keap l-Nrf2通路是EPO增强神经细胞抗氧化损伤能力的关键通路之一。由此我们提出假设：EPO通过调控Keap l -Nrf2通路，调节抗氧化酶表达，增强机体抗氧化能力，发挥抗神经衰老作用。本研究拟在衰老神经细胞及大鼠模型上应用免疫组织化学、分子生物学等实验手段观察EPO-TAT干预前后PI3K、Nrf2、Keap-1、MafG、抗氧化酶及自由基的变化，从细胞及活体动物两个层面来验证关于EPO通过调控Keap l-Nrf2通路来增强抗氧化作用，发挥抗神经衰老的假设，期望完善EPO抗神经衰老机制，为EPO最终应用于临床抗神经衰老提供理论依据。

研究背景：人口老龄化已经成为21世纪一个重要问题。我们已证实EPO抗衰老作用。实验方法：动物实验：大鼠颈背部皮下注射D-半乳糖建立大鼠衰老模型。通过侧脑室注射EPO及各通路抑制剂进行干预。水迷宫检测各组大鼠的学习记忆能力。细胞实验：建立皮层神经元长程培养体系。选择以DIV7为对照组，DIV20天为模型组。以LY294002特异性阻断PI3K/Akt的活化。实验结果：动物实验：模型组较对照组大鼠学习记忆能力下降，Nrf2、p-Akt、p-ERK、Cu-Zn SOD以及Nrf2基因表达下降，Keap1基因表达升高；EPO干预组与模型组相比，学习记忆能力提高，海马CA1区Nrf2、p-Akt、p-ERK、Cu-Zn SOD以及Nrf2基因表达升高，Keap1基因表达下降；EPO加LY294002抑制组较EPO干预组学习记忆能力下降，Nrf2、p-Akt、Cu-Zn SOD以及Nrf2基因表达减少，Keap1基因表达增加，与模型组相比无差异。EPO干预加PD98059抑制组大鼠较EPO干预组学习记忆能力下降，Nrf2、p-ERK、细胞核Nrf2、Cu-Zn SOD以及Nrf2基因表达明显减少，Keap1基因表达增加，与衰老模型组相比差异不大。细胞实验：模型组较对照组p-AKT、AKT、pPPARγ的蛋白表达升高，存活神经细胞数目减少，细胞明显萎缩，体积缩小；EPO干预组较模型组p-AKT、AKT、PPARγ、CuZn SOD的蛋白表达显著升高，存活神经细胞数目较多，凋亡减少，细胞形态更为规则；EPO干预加LY294002抑制组较EPO干预组p-AKT、AKT、总PPARγ、核内PPARγ、pPPARγ、CuZn SOD的蛋白表达降低，与模型组相比无明显差异，存活细胞数目及形态基本同模型组。结论：大鼠背部皮下注射D-半乳糖建立大鼠衰老模型是简单、有效、可行的。皮层神经元长程培养是模拟神经系统自然衰老的良好模型。EPO发挥抗衰老作用，可能提高PI3K-AKT、MAPK-ERK的表达，增加Nrf2蛋白水平，促进Nrf2的核转位，维持MDA、CuZn SOD等抗氧化酶高表达及活性有关。EPO亦可通过PI3K-AKT影响PPARγ表达，也可通过影响BDNF的表达发挥抗衰老作用，但其具体机制及信号通路转导尚需进一步实验证实。