E3泛素连接酶RNF8在肺癌转移中的作用及机制研究

Lung cancer is the most lethal malignant tumor worldwide , and invasion and metastasis are the main causes of mortality in patients. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) plays an pivotal role in the metastasis of lung cancer. However, the pathological mechanism remains unclear yet. RNF8, a RING finger E3 ligase, was characterized for its involvement in DNA damage repair via ubiquitination, and was only reported to promote tumor metastasis in breast cancer. Our Previous studies showed that RNF8 was highly expressed in lung cancer tissues and was negatively correlated with Overall Survival of patients. Overexpression of RNF8 promoted the EMT process and migration ability of lung cancer cells. Based on the current knowledge, we will focus on investigating the role of RNF8 in the EMT process of lung cancer, with a combination of up-to date methods including Western Blotting and co-immunoprecipitation at molecular level; RNAi, Overexpresion, Rescue assays at cellular level and Tumor formation assay at animal level. In this way, we anticipate to reveal the molecular pathway of RNF8 in lung cancer metastasis. This work may find new molecular mechanisms for lung cancer metastasis and provide an important evidence whether RNF8 could serve as a potential diagnosis and treatment target of lung cancer.

肺癌是全球致死率最高的恶性肿瘤，浸润转移是其致死的主要原因。上皮间质转换（EMT）在肺癌转移中发挥重要作用，然而其病理机制有待进一步明确。RNF8是RING家族的E3泛素连接酶，通过泛素化在DNA损伤修复中起重要作用，与肿瘤转移的关系仅在乳腺癌中报道。针对肺癌，我们前期研究发现：RNF8在肺癌组织里高表达；且与病人总体生存率呈负相关；在肺癌细胞中干预RNF8表达则显著影响其EMT和细胞迁移能力。在此基础上，本项目拟从分子生物学水平通过免疫印迹、免疫共沉淀等方法揭示RNF8调控肺癌EMT的分子机制；在细胞水平通过敲减、过表达、Rescue等手段验证通路的细胞学效应；并建立荷瘤小鼠模型，在体研究RNF8对肺癌转移的影响。通过上述研究，能明确RNF8在肺癌转移中的作用和机理，提出肺癌转移的新机制，为RNF8作为肺癌诊疗靶点的可能性提供重要证据，具有重要理论和临床意义。

本项目从肺癌组织、细胞水平、动物实验三个层面，阐明了RNF8在促进肺癌发生发展中的作用，RNF8通过对肺癌细胞上皮间质转换（EMT）的调控影响肺癌细胞的侵袭、转移的作用和机制，为RNF8作为肺癌及其他恶性肿瘤诊疗靶点的可能性提供了重要证据。利用开放性肿瘤数据库、采集的肺癌肿瘤/对照样本，分析研究了RNF8的表达与肺癌临床表现的相关性，RNF8在肺癌组织中高表达并且与肺癌病人的预后负相关；通过敲减、过表达、免疫印迹、划痕实验、Transwell等方法得出RNF8促进EMT及增加细胞迁移能力。利用免疫共沉淀、质谱联用等方法揭示RNF8调控肺癌EMT的分子机制，以及利用Rescue实验，证实：RNF8调控PI3K/Akt信号通路；RNF8酶活性为其发挥促EMT功能所必须，促EMT关键转录因子Slug是其酶学底物，RNF8通过K63泛素化调控Slug的活性，并且Slug为RNF8促进肺癌EMT进程所必需。通过荷瘤小鼠模型，敲低RNF8抑制肺癌细胞系在体内的转移。此外，我们还对RNF8基因的新功能及机制进行了拓展分析：探索调控RNF8参与肺癌发生发展的上游机制的探究，证实miR-654调控RNF8参与肺癌的发生发展。此外，通过生物信息学分析建立一个综合性的、高特异性的RNF8互作调控网络，鉴定出了大量的RNF8靶点蛋白，从而为RNF8提供了一个完整的功能靶点图谱。此外，在湖南省自然科学青年基金的共同资助下，我们也探究了RNF8促进肝癌转移，敲低RNF8能增强肝癌细胞系对肝癌一线治疗药物索拉菲尼（sorafenib）和仑法替尼（lenvatenib）的药敏性。这些RNF8新功能与新机制的原创性探索，极大丰富了我们对RNF8功能的理解，为阐明RNF8的功能提供了重要依据，具有重要临床意义。