利用诱导多能干细胞分化的神经细胞研究恶性胶质瘤的细胞起源和发生机制

The cell of origin of malignant gliomas has been an issue for the discussion, with evidence indicating neural stem cells, oligodendrocytes or astrocytes. However, it remains ambiguous whether neurons can be transformed to tumor cells. In this proposal, instead of animal models failing to faithfully recapitulate human brain tumors, we use the technology of induced pluripotent stem (iPS) cells to reprogram human skin fibroblasts from glioma patients and health controls, then directly differentiate iPS cells into neural stem cells, neurons, oligodendrocytes and astrocytes in the defined media. We are also endeavoring to produce homogenous, well-characterized neural populations. Accumulating evidences implicate that the carcinogenesis is associated with down-regulation of Neurofibromin 1 (NF-1) and p53, which enlightens us to obtain brain tumor cells by the co-infection of NF-1 shRNA (h) Lentiviral Particles and p53 shRNA (h) Lentiviral Particles, or the exposure to N-Nitrosodimethylamine, a known carcinogen. Through the in vitro and in vivo experiments of cell growth, migration, invasion, soft agar cloning, tumor formation in nude mice, cell engraft into striatum and RNA-Seq, we plan to explore whether neural cells from patients with gliomas are easily to be transformed, transformed cells are characterized as tumor cells, and carcinogenesis-relevant signaling pathways are activated. This application not only helps address the fundamental question of the cell origin of glioma, but also offers a functional screening platform for carcinogen assessment and personalized medication to patients with malignant gliomas.

研究表明神经干细胞、少突胶质细胞及星型胶质细胞是恶性胶质瘤的来源，然而神经元是否也会受到攻击而转变为肿瘤细胞，这一问题尚不清楚。鉴于动物模型不能真实解释人脑中肿瘤发生机制，本项目拟应用课题组已掌握的iPS细胞及定向神经分化技术，将胶质瘤病人和健康人群皮肤成纤维细胞重编程为干细胞，再定向分化成神经干细胞、神经元、少突胶质细胞和星型胶质细胞，并筛选出同质类型神经细胞群。接着用神经纤维瘤蛋白1（NF-1）shRNA和p53 shRNA病毒共感染，或用确认致癌物亚硝胺处理，诱导细胞转化。用细胞生长和周期、体外迁移侵袭、软琼脂克隆形成、裸鼠体内成瘤、小鼠纹状体细胞移植和RNA测序等体内外手段，来观察这些胶质瘤病人细胞是否容易被转化，恶转后的细胞是否具有肿瘤生物学特性，以及肿瘤信号通路激活等。研究旨在不仅探讨恶性胶质瘤的细胞起源和发生发展机制，而且为致肿瘤化合物和胶质瘤敏感药物提供一个良好的筛选平台。

关于恶性胶质瘤的细胞来源问题仍存在争议。鉴于动物模型不能真实解释人脑胶质瘤发生机制，本项目应用诱导多能干细胞（iPSCs）及定向神经分化技术，将胶质瘤病人和健康对照分离培养的皮肤成纤维细胞重编程为干细胞，再定向分化成神经干细胞及神经元、星型胶质细胞等。接着用确认致癌物亚硝胺处理，诱导神经细胞恶性转化。最后观察恶转后的细胞是否具有肿瘤生物学特性，以及胶质瘤病人细胞是否更容易被转化，并探讨肿瘤信号通路激活情况。首先，本研究收集了胶质瘤患者和正常对照的皮肤组织，分离培养了皮肤成纤维细胞，经过iPSCs重编程，成功建立了iPSCs。其次，本研究优化了iPSCs定向分化为神经元的方法，并重点探讨了染色体重塑基因、TETs基因、Vit C在iPSCs经神经干细胞分化为成熟神经元过程中的作用。结果发现，TET2/3基因在神经元分化中发挥了关键作用。并且，Vit C可能是通过调节TET2/3和Vit C转运蛋白，从而升高DNA甲基化水平，最终促进神经元分化、成熟及活性。接着，将iPSCs定向分化为神经干细胞、神经元及其他神经细胞。免疫荧光鉴定结果提示，成功获得了iPSCs分化的神经细胞。然后，重点应用星形胶质细胞，构建胶质瘤模型。我们用小鼠分离培养的星形胶质细胞摸索出了亚硝胺低剂量长时间恶心转化的条件。在此基础上，将iPSCs分化的星形胶质细胞用低剂量亚硝胺处理了6个月，应用细胞周期、细胞生长曲线、平板克隆形成实验、Transwell侵袭实验、Transwell迁移实验、RNA测序、小鼠成瘤等体内外手段检测了转化后细胞的生物学特征，以及相关激活的肿瘤信号通路。结果发现胶质瘤和正常对照来源星形胶质细胞均发生了恶性转化，但并未发现两者之间存在显著性差异。恶性转化后，人金属硫蛋白MT2A、干扰素刺激基因15、干扰素诱导蛋白6、骨髓基质细胞抗原2、趋化因子CXCL8等低表达。总之，本研究利用重编程等技术，获得了iPSCs来源的神经细胞，更重要的是利用星形胶质细胞，成功构建了胶质瘤模型。本研究用人体来源细胞，经体内外实验，明确了星形胶质细胞是胶质瘤的细胞来源之一。