蟹类精氨酸激酶的过敏性及其构效关系研究

蟹类等甲壳动物是联合国粮农组织公布的八大类过敏食物之一，但国内外有关蟹类过敏原及其构效关系的研究尚不够深入。本研究以拟穴青蟹、中华绒螯蟹、梭子蟹等常见蟹类为对象，首先分析明确不同蟹类精氨酸激酶（AK）的过敏性，并实现蟹类重要过敏原AK的分离纯化。其次利用蟹类过敏病人血清建立AK的免疫球蛋白E（IgE）结合活性测定方法，并以纯化的AK建立小鼠过敏模型及过敏性分析方法。最后采用蛋白质组学结合免疫学实验，分析比较天然完整型、变性直链型AK与IgE的结合活性，明确AK与IgE抗体结合的抗原表位类型；完成AK的分子克隆，分析AK的序列及结构，预测AK的抗原表位，并以大肠杆菌分段表达法判定AK的抗原表位区域，以蛋白酶水解后多肽片段的质谱分析法确定AK的抗原表位，深入解析AK的IgE结合活性、过敏性与结构之间的关系，为今后利用改性处理或分子改造技术研发低致敏性食品提供理论依据和技术参考。

食物过敏作为食品安全的热点问题在全球引起了广泛关注，甲壳类动物是联合国粮农组织（FAO）公布的八大类过敏食物之一。蟹类等甲壳类水产品味道鲜美、营养丰富，是重要的水产资源；但随着蟹类消费量的增加，因食用蟹类而导致过敏的报道也随之增多。据报道，精氨酸激酶（Arginine kinase，AK）是存在于甲壳类和软体动物中的泛过敏原，然而目前对AK抗原表位的研究还较少，对其抗原表位及构效关系的全面了解能够为开发低致敏食品奠定提供依据。.本研究以拟穴青蟹为研究对象，通过饱和硫酸铵盐析和阴离子交换柱层析的方法分离纯化得到AK，并证实AK是分子量为40 kDa，等电点为6.5的糖蛋白。稳定性试验结果表明，AK不耐热，经热处理（> 44 °C）的AK易形成二聚体和多聚体。模拟胃肠液消化实验结果表明，AK易被胃蛋白酶降解，且经胃蛋白酶酶解的AK仍具有IgE结合能力。对AK进行分子克隆得到AK的cDNA序列全长1457 bp，其中开放阅读框（Open reading frame，ORF）长1074 bp，编码357个氨基酸。核苷酸序列和其推导氨基酸序列在Genbank登录号分别为：JN828652和AFA45340。通过生物信息学分析，采用SWISS-MODEL服务器对拟穴青蟹AK进行自动建模，得到其三维结构。.利用噬菌体展示的方法，通过生物淘选得到4个构象表位C-AK-1（D3A4K43M1A5T49T44I7）、C-AK-2（L31K33V35T32E11E18F14S34D37）、C-AK-3（V177G172M173D176Q178T174L181K175L187）和C-AK-4（R202L170Y203E190P205W204L187T206Y145）。根据噬菌体展示淘选结果设计合成了19个重叠肽段，利用甲壳类过敏患者血清检测结合肥大细胞（RBL-2H3）脱颗粒实验确定AK的4个线性表位：L-AK-1（AA：113-127），L-AK-2（AA：127-141），L-AK-3（AA：141-155）和L-AK-1（AA：204-218）。.利用变性剂处理天然AK，通过免疫印迹检测变性处理后AK的IgE结合活性变化，结果表明AK的致敏性依赖于其空间构象的完整性，存在于分子内部的二硫键Cys201-Cys271对于维持AK的空间构象具有关键作用，是影响AK致敏性的关键位点。