HIV-1 Tat对Tip60/DNA-PKcs相互作用、乙酰化修饰和DNA修复功能的影响及机制研究

临床观察发现HIV-1病毒感染者肿瘤组织对放射的敏感性增强，前期研究表明HIV-1 Tat蛋白显著提高宿主细胞的放射敏感性、抑制细胞DNA双链断裂修复。最近有报道与Tat相结合的宿主蛋白Tip60通过其乙酰基转移酶活性，影响细胞的DNA损伤修复蛋白DNA-PKcs活性。本项目在前期工作基础上，研究HIV-1 Tat蛋白是否通过Tip60途径对细胞辐射反应产生影响和机理，内容包括：1）确定Tat / Tip60 / DNA-PKcs相互作用关系；2）Tat对细胞受照后Tip60的乙酰基转移酶活性变化的影响；3）Tat是否影响Tip60对DNA-PKcs蛋白活性的调节作用、与蛋白乙酰化修饰的关系，以及引起下游分子激活和辐射损伤细胞学反应的改变。将为揭示HIV-1 Tat蛋白与宿主关键功能蛋白的相互作用、对细胞辐射敏感性的影响，以及改善肿瘤放射治疗疗效的措施研究，提供新的实验和理论依据。

Tip60（Tat interaction protein，60）最初是作为HIV病毒蛋白Tat相互作用的宿主细胞蛋白而被发现的，具有乙酰转移酶活性，可以使组蛋白的赖氨酸残基发生乙酰化修饰，具有基因转录调节功能。Tip60对DNA损伤修复的调节作用也开始受到重视，有文献报道，当Tip60与乙酰辅酶A的结合位点Q377、G380突变后，细胞修复DNA损伤能力下降。我们前期研究报道了HIV-1Tat蛋白通过调节DNA-PKcs以及Cyclin B1的表达，抑制细胞的DNA放射损伤修复以及细胞周期响应，本研究探讨了Tip60与DNA-PKcs等相互作用对电离辐射诱发的DNA损伤修复及细胞周期阻滞的影响和相关机制。研究首先表明Tip60基因沉默细胞的细胞辐射敏感性明显增加。相反，增强Tip60的表达，引起细胞DNA损伤识别感应增强，提高细胞的DNA修复的能力，增强辐射抗性。研究证实Tip60在DNA损伤刺激的情况下与DNA-PKcs有相互作用，Tip60的抑制剂漆树酸可以抑制电离辐射后DNA-PKcs pT2609和pS2056的磷酸化。发现Tat蛋白能够抑制DNA-PKcs启动子的活性，Tat蛋白不仅对DNA-PKcs启动子的核心区域有抑制作用，还对启动子的非核心区域的转录活性有抑制作用。Tip60的过表达引起电离辐射诱发G2/M期阻滞较对照细胞延长，同时发现，这种延长G2/M期阻滞的作用可能与Cyclin B和Cdk 1的表达下调有关。利用本实验室建立的染色质大规模重构技术，证实Tip60在电离辐射后，对染色质大规模重构的作用明显增强，同时Tat蛋白具有大规模染色质重构功能，受照情况下，这种作用减弱。通过构建不同的突变体发现Tat蛋白的28、50和51位的赖氨酸在染色质重塑中发挥着重要的功能。意外的是，Tat蛋白提高细胞内DNA-PKcs/pS2056的磷酸化水平，引起细胞内产生特征性γ-H2AX foci。通过DNA-PK激酶检测试剂盒的检测，发现Tat蛋白在体外能够明显的激活DNA-PKcs激酶活性。Tat 在体内外与DNA-PKcs相互作用，在胞核内有共定位。通过PI、GST-pull down发现Tat 在体内外与Plk1和Chk2、Tip60与PLK1， Tip60与Cyclin B1相互作用，形成多元复合物，参与放射损伤细胞周期进程调节。