DNA-PKcs和PLK1相互作用偶联DNA修复与细胞有丝分裂调节

DNA修复和细胞周期监测点对于维持细胞基因组稳定、抑制肿瘤发生起着至关重要的作用，同时是肿瘤治疗的分子靶点之一。前期研究发现，DNA损伤修复蛋白DNA-PKcs失活细胞在γ射线照射后，出现有丝分裂灾变死亡。同时DNA-PKcs与有丝分裂激酶PLK1相互作用， DNA-PKcs/pT2609与PLK1共定位。质谱分析鉴定出PLK1上的一个DNA-PKcs磷酸化位点。本项目在前期工作基础上，研究DNA-PKcs与PLK1相互关系及二者偶联在DNA损伤后细胞周期调控中的作用，内容包括1）DNA-PKcs调节PLK1稳定性及机制；2）DNA损伤后DNA-PKcs磷酸化PLK1的变化规律；3）PLK1被DNA-PKcs磷酸化在DNA损伤后细胞周期调控中的意义。将更深入的了解DNA-PKcs、PLK1蛋白在DNA损伤后细胞周期调控中的重要功能，也将为临床肿瘤治疗开拓新思路。

本研究首次发现DNA-PKcs-PLK1信号通路在正常或DNA损伤偶联的有丝分裂过程中的重要功能：.（1） DNA损伤修复蛋白DNA-PKcs与PLK1存在体内、体外相互作用，DNA-PKcs可磷酸化PLK1蛋白S331位点；DNA-PKcs沉默或活性抑制细胞中，PLK1蛋白半衰期显著延长。有趣的是，在DNA-PKcs缺失的细胞系中，PLK1蛋白激酶活性反而降低，表明DNA-PKcs是PLK1激酶活性的促进因子；在此基础上我们提出调控模型如下：DNA-PKcs磷酸化PLK1可促进PLK1活性，在PLK1发挥功能后，这种磷酸化作用开启了蛋白降解的“开关”。这种工作模型既能促进PLK1高效的发挥功能，又保证PLK1在功能完成后迅速降解，从而对其进行严格的时空调控。这种调节方式有助于维持基因组稳定性，抑制肿瘤发生；.（2）DNA损伤发生后，PLK1在DNA-PKcs缺失或活性抑制细胞中失调控，诱发有丝分裂灾变。利用不同细胞模型得到的结果显示，DNA-PKcs失活所诱发的有丝分裂灾变死亡依赖于P53蛋白状态；.（3）作为PLK1上游激酶，DNA-PKcs在正常细胞有丝分裂过程中作用也非常重要。研究发现，DNA-PKcs通过PLK1参与细胞有丝分裂期多个过程，包括有丝分裂期进入（G2/M转换）、中心体微管组装、微管与着丝粒粘附以及胞质分裂过程。具体阐明详见下文。DNA-PKcs缺失将导致G2/M转换延迟，纺锤体装配失调控，着丝粒与纺锤体微管粘附异常，PLK1在胞质分裂期中体结构上无法磷酸化激活而导致胞质分裂失败，一系列有丝分裂异常的结果是DNA-PKcs缺失导致染色体不稳定增加；.（4）PLK1蛋白功能紊乱在人类肿瘤中时常发生且与患者预后不良相关。本研究发现DNA-PKcs缺失细胞对PLK1抑制剂BI2536更敏感，BI2536导致更为严重的细胞周期阻滞和细胞凋亡。PLK1抑制剂BI2536与DNA-PKcs抑制剂Nu7441联合作用有非常明显的协同治疗效果。.（5）我们发现翻译调控蛋白4E-BP1在有丝分裂期定位于中心体和着丝粒结构，与PLK1共定位。进一步通过免疫沉淀和GST-沉降技术发现，4E-BP1与PLK1蛋白存在直接相互作用。沉默4E-BP1将导致细胞有丝分裂异常。