DNA-PKcs的泛素化修饰对DNA-PK活性的调节机制

DNA损伤修复通路对维持细胞基因组的稳定性至关重要。DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）是基因组DNA损伤修复过程中的关键蛋白激酶，它参与并决定着非同源末端连接修复通路的整个进程。DNA-PK活性的异常升高或降低与多种疾病的发生、发展密切相关，因此其活性调节机制备受关注，但尚不明朗。我们发现泛素化蛋白分子伴侣VCP和DNA-PKcs相互结合，利用VCP siRNA下调VCP蛋白表达，能够上调DNA-PKcs全长的蛋白量；免疫共沉淀实验证实U251脑胶质瘤细胞中DNA-PKcs存在泛素化，提示DNA-PK活性很可能受到泛素化水平的修饰调节。本项目拟对DNA-PKcs的泛素化修饰进行深入研究，寻找DNA-PKcs泛素化修饰功能位点，观察这些位点突变后对DNA-PKcs蛋白量、细胞内定位和活性的影响。本课题旨在寻找DNA-PK新的活性调控机制，为揭示DNA-PK在细胞中的重要作用提供理论依据。

DNA损伤修复通路对维持细胞基因组的稳定性至关重要。DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）是基因组DNA损伤修复过程中的关键蛋白激酶，它参与并决定着非同源末端连接修复通路的整个进程。含缬酪肽蛋白（valosin containing protein, VCP）是泛素化蛋白分子伴侣，它的氨基端能够与泛素化蛋白的多泛素链结合，使之进入蛋白酶体进行降解；也可以和泛素化蛋白结合，去折叠从而改变蛋白构象，调节蛋白活性和细胞内定位。迄今为止，VCP是否参与DNA-PKcs降解并调节脑胶质瘤的放疗敏感性尚不清楚。我们发现U251脑胶质瘤细胞中DNA-PKcs存在泛素化，VCP和DNA-PKcs相互结合。VCP siRNA下调VCP蛋白表达，上调DNA-PKcs蛋白量，蛋白酶体抑制剂MG132协同此效应。DNA-PKcs蛋白上调引起DNA-PK活性上调，DNA损伤修复效率增加，脑胶质瘤细胞放疗敏感性降低。体内实验结果也显示VCP siRNA显著缩短U87脑胶质瘤原位移植瘤裸鼠放疗后生存周期。WHO临床IV级星形细胞瘤数据库分析也显示25%的脑胶质瘤组织中VCP蛋白低表达，VCP蛋白水平与病人生存周期呈正相关。上述结果显示VCP可通过促使DNA-PKcs降解，从而提高脑胶质瘤细胞放疗敏感性。