DNA-PKcs通过SCF泛素连接酶调控EXO1蛋白稳定性及其DNA同源重组修复中的末端剪切功能机制研究

DNA double-strand break (DSB) is a severe damage induced by ionizing radiation. There are two major pathways of DSB repairing in eukaryotic cells: homologous recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ). The yield 3’ssDNA of DSB through the end resection is a key reaction for initiating HR pathway, also a key regulation point for the DSB repair pathway choice. In our previous study, we found the inaction of DNA-PKcs led to a significant decrease of expression and protein stability of the exonuclease EXO1, the critical molecule of executing DSB end resection of HR pathway. Here, this project will further study the upstream signaling pathway and downstream repair function of EXO1 ubiquitination regulated by DNA-PKcs, including: The effects of DNA-PKcs on the alterations of EXO1 ubiquitination and phosphorylation, and the stability after irradiation and in different cell cycle phases; the regulation mechanism of EXO1 ubiquitination by SCF E3 ubiquitin ligase, especially focus on by the direct action and through interaction with RBX1, DNA-PKcs regulates the neddylation of Cullin-1, a component of SCF E3 ubiquitination ligase catalytic core, and its ubiquitin ligase activity on EXO1. Through the observation of DSB end resection reaction, to further elucidate the regulation mechanism of DNA-PKcs on EXO1 repair function. This project will provide further mechanism theory to advance our knowledge on radiation biology.

DNA双链断裂（DSB）是放射诱发的严重损伤，真核生物有同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ) 两条主要修复通路。DSB经末端剪切形成一段单链DNA，是启动HR修复的关键，也是修复通路选择的调控点。前期发现，DNA-PKcs失活将导致执行DSB末端剪切的核酸酶EXO1的表达和稳定性显著改变。本课题将深入开展DNA-PKcs调控EXO1泛素化降解的上游信号通路和下游修复功能的研究：明确DNA-PKcs对放射损伤及细胞周期（G1 vs G2）EXO1表达和修饰（泛素化、磷酸化等）的影响规律；探讨SCF E3泛素连接酶对EXO1泛素化的调控机制，重点是DNA-PKcs直接或通过与RBX1的相互作用，对SCF催化核心Cullin-1蛋白的类泛素化修饰及作用于EXO1的活性调控机制；通过观测DSB末端剪切，明确DNA-PKcs通过上述作用对EXO1功能的调控机制，加深对放射生物学机制理论认识。

DNA双链断裂（DSB）是电离辐射（IR）诱导的最为严重的DNA损伤形式之一，深入研究其精确修复机制，对发展新型放射损伤防护药物、维持基因组的稳定性具有重要意义。DSB的修复通路，主要包括同源重组（HR）修复和非同源末端链接（NHEJ）修复，其中HR修复通路需要同源DNA作为修复模板，仅发生在S/G2期，而G1期细胞只能选择NHEJ修复通路，因此，两者在不同细胞周期的选择和转换对DSB精确修复非常重要。在G1期细胞中，由于缺乏基因组范围内同源DNA(姐妹染色单体DNA尚未合成)，因此无法试行和完成HR修复，G1期细胞是如何限制HR修复，确保G1期NHEJ修复顺利进行的机制尚不完全清楚。在DNA双链断裂（DSBs）同源重组修复通路起始阶段，需要进行DSB末端单链切割形成HR修复所必须的末端单链DNA (ssDNA)，本研究围绕此过程的关键执行者EXO1的功能调节，以及DNA-PKcs在其中的调控作用展开研究，取得了具有重要理论意义和实践价值的科学发现，主要包括：（1）发现EXO1蛋白在G1期细胞中发生泛素化修饰，由此介导其降解，而在G2期细胞中EXO1蛋白表达较高，以便其执行功能；（2）揭示了RBX1蛋白促进SCF E3泛素连接酶关键组分Cullin 1的类泛素化修饰，促使其介导EXO1蛋白降解；（3）揭示RBX1蛋白促进G1期细胞EXO1泛素化降解对电离辐射损伤具有保护作用；（4）揭示DNA-PKcs激酶在G1细胞的自磷酸化和激酶活性显著高于G2期细胞，由此导致G1期细胞RBX1的高表达。上述科学发现，阐述了一种促进细胞DNA双链断裂修复通路的精确选择的新机制——DNA-PKcs在G1细胞中上调RBX1表达、介导EXO1蛋白泛素化降解，从而限制G1期细胞对DSBs的末端DNA单链切割，避免选择无法完成的HR修复通路，以便于执行非同源末端连接修复通路。本研究的科学发现为深入阐述放射致DNA双链断裂的修复机制提供了科学证据，为发展更有效的放射损伤防护技术奠定理论和实验基础。