噬菌体早期蛋白Gp70.1通过宿主RpoS抑制铜绿假单胞菌的作用与机制

RpoS is an important σ factor that responsible for the stress response of bacteria, which is closely associated with the expression virulence genes, resistance generation, and quorum-sensing in bacteria. It has been showed that some early proteins produced by bacteriophage can take over the host cellular resources and inhibit or even kill bacteria. Our previous work revealed the antibacterial effects of the early protein phage Gp70.1 encoded by Pseudomonas aeruginosa phage PaP3, where the mechanism is unclear. Molecular docking analysis showed that Gp70.1 could interact directly with host RpoS. Their interaction was confirmed by bacterial two-hybrid and pull-down analysis. It is inferred that Gp70.1 inhibits bacteria by interacting with host RpoS. To confirm this, the project is designed to determine the key binding site between Gp70.1 and RpoS by truncated protein and site-directed mutagenesis. Furthermore, ChIP-seq, in vitro transcription, and reconstruction of RNA polymerase will be adopted to examine the effect of Gp70.1 on the regulatory function of RpoS. This research will provide a theoretical basis for screening the phage derived antibacterial agents.

RpoS是细菌负责应激反应的重要σ因子，与细菌毒力基因表达，耐药性产生，群体信号反应等密切相关。研究表明，许多噬菌体的早期蛋白可挟持细菌的生长，发挥抑菌或杀菌功能。我们前期发现铜绿假单胞菌噬菌体PaP3编码的早期蛋白Gp70.1具有显著的抑菌功能，但机制不清。采用分子对接分析发现Gp70.1可能与宿主的RpoS发生直接相互作用，细菌双杂交实验证实两者存在相互作用，由此推测噬菌体Gp70.1通过与宿主RpoS相互作用而发挥抑菌功能。为证实这一推测，本项目拟采用截短蛋白，定点突变等实验进一步验证Gp70.1与RpoS的相互作用，阐明Gp70.1发挥抑菌功能的分子机制；结合ChIP-seq分析Gp70.1对RpoS调控功能的影响，体外检测Gp70.1作用下，RpoS结合核心酶能力的变化及对靶序列结合力的差异，明确Gp70.1影响RpoS的调控功能，为筛选新型的噬菌体源性抗菌制剂奠定理论基础。

细菌的抗生素耐药性已经成为全球性的公共卫生问题，仅2019年抗生素耐药性就导致了127万人的直接死亡以及495万人的间接死亡，成为仅次于心脏病和中风的全球第三大死亡病因。本项目以筛选新型抗菌制剂为出发点，基于项目负责人前期研究基础：铜绿假单胞菌噬菌体PaP3编码的早期蛋白Gp70.1具有显著的抑菌功能，但Gp70.1的抑菌机制和抑菌机制尚不清楚。项目负责人前期通过细菌双杂交实验和分子对接分析其作用初步显示Gp70.1的作用靶点可能是细菌的RpoS蛋白。为进一步明确噬菌体早期蛋白Gp70.1的作用靶点并深入解析噬菌体早期蛋白Gp70.1的抑菌机制，本项目展开了RpoS蛋白的敲除试验，铜绿假单胞菌的重测序比较基因组学和肠道来源微生物组学等研究。RpoS敲除实验显示，尽管RpoS与Gp70.1在前期的细菌双杂交实验和分子对接分析中存在特异性结合，但这种结合并不是GP70.1发挥抑菌作用的关键或者RpoS并不是噬菌体蛋白Gp70.1发挥抑菌作用的唯一靶点。为了不将Gp70.1的抑菌机制研究局限在PA3-PaP3的研究体系中，我们将研究范围进行扩大，大胆尝试从临床上一株多重耐药的鲍曼不动杆菌入手，利用全局性的转录组学分析，从该细菌的噬菌体中筛选出可能的抑菌编码基因。此外，肠道菌群是细菌和噬菌体基因的重要数据资源，是研究耐药菌，筛选新型抗菌蛋白的创新资源，可收集利用肠道宏基因组学研究方法获得的噬菌体序列产物，利用创新的生物信息学算法，如特征筛选技术，机器学习等，分析Gp70.1的抑菌机制。