猪δ冠状病毒辅助蛋白拮抗I型干扰素的机制及其对致病性的影响

Porcine deltacoronavirus (PDCoV) is an emerging swine enteric coronavirus. As the sole deltacoronavirus that has been successfully isolated in cell culture system, PDCoV can be used as a good model for studying deltacoronaviruses, posssessing very important reference values on the basic study of deltacoronaviruses. Accessory proteins are genus/species-specific for coronavirus. Although coronavirus accessory proteins have generally been considered to be dispensable for viral replication in vitro, extensive functional studies have shown that many accessory proteins are involved in immune modulation, viral titer and pathogenicity. The field of coronavirus accessory proteins has gained considerable attention in recent years. Our recent studies demonstrated that PDCoV infection suppresses RIG-I-like receptors (RLRs)-mediated type I interferon (IFN) production and signaling pathway. We also found that PDCoV encodes three accessory proteins, NS6, NS7, and NS7a. Furthermore, all three accessory proteins possess the ability to antagonize the host’s IFN responses. In this project, we plan to study the underlying mechanism(s) utilized these accessory proteins to antagonize type I IFN production and signaling pathway, identifying the targeted molecule(s) among the type I IFN pathway and the possible domain(s) or key amino acid residue(s) of accessory proteins responsible for its IFN inhibitory property. By using the PDCoV reverse-genetic system, we will construct and rescue recombinant PDCoV deleting one or multiple accessory protein genes, and evaluate the biological characteristic and pathogenicity of these recombinant PDCoV, revealing the functions of accessory proteins in immune modulation and pathogenicity. Our study will lay the foundation for better understanding the mechanism(s) of immunity and pathogenesis of PDCoV.

猪δ冠状病毒（PDCoV）是一种新发现的肠道冠状病毒，也是目前唯一在体外成功分离的δ冠状病毒，可作为研究δ冠状病毒属的模型，具有重要的基础研究价值。冠状病毒的辅助蛋白是一类功能特殊的蛋白，虽然是病毒增殖非必需的，但在调控宿主天然免疫、病毒增殖滴度与致病性中发挥重要作用。我们前期研究发现PDCoV拮抗RIG-I样受体介导的I型IFN产生以及IFN刺激基因表达，证实PDCoV编码三种辅助蛋白（NS6、NS7、NS7a），而且三种辅助蛋白均能拮抗I型IFN。本项目拟对PDCoV辅助蛋白拮抗I型IFN产生与信号转导的机制进行深入研究，确定其作用的靶点以及发挥作用的功能域或关键氨基酸位点；借助建立的反向遗传操作系统，构建单个或多个辅助蛋白缺失/突变的重组病毒，比较不同重组病毒的生物学特性与致病性差异，从体外和体内揭示辅助蛋白的免疫调节功能及其对致病性的影响，为阐明PDCoV的致病与免疫机理奠定基础。

猪δ冠状病毒（PDCoV）是一种新发现的肠道冠状病毒，主要引起新生仔猪腹泻，但同时具有感染人的潜能。冠状病毒的辅助蛋白是一类功能特殊的蛋白，可能参与病毒复制、调控天然免疫以及致病性。在我们的前期研究中，鉴定了三种PDCoV辅助蛋白（NS6、NS7、NS7a），并初步发现这三种辅助蛋白均能拮抗I型IFN，但其作用机制尚不清楚。本项目对这三种辅助蛋白拮抗I型干扰素的机制及其对致病性的影响进行了深入研究。我们首先筛选并获得对PDCoV高度易感的猪源细胞，建立了两种猪肠道类器官培养技术和PDCoV反向遗传操作系统，发展了一种快速构建PDCoV重组病毒的新技术。利用建立的技术与平台，分析了辅助蛋白拮抗IFN产生与信号转导的分子机制，发现NS6与RIG-I/MDA5发生相互作用，阻碍RIG-I/MDA5与dsRNA的结合，从而拮抗I型干扰素产生；NS7和NS7a均抑制I型干扰素产生，但NS7a的抑制效果更强，NS7a特异性靶向IKKε，致弱IKKε与TRAF3、IRF3的结合，抑制RLR介导的IFN-β产生。通过构建辅助蛋白缺失或突变的重组病毒，发现NS6缺失显著降低病毒的增殖能力；NS6可诱导内质网应激、与囊泡分选蛋白VPS35/VPS26/VPS29均存在相互作用并参与病毒的囊泡运输；发现NS7a蛋白能明显增加细胞膜通透性并提高胞内钙离子浓度，是一种病毒孔道蛋白，而且NS7a还具有诱导膜融合的功能。除了解析辅助蛋白拮抗I型IFN的机制，我们还发现PDCoV可拮抗III型干扰素产生，PDCoV编码的非结构蛋白nsp5、nsp10、nsp15也具有拮抗干扰素反应的能力并解析了其作用机制，为阐明PDCoV的免疫机理奠定了基础。项目执行期内，在Journal of Virology、Emerging Microbes & Infection、Veterinary Microbiology等期刊发表研究论文23篇，参编英文专著《Diseases of Swine》第11版的Coronavirus章节，申报国家发明专利5项（其中1项已经授权）；培养研究生11名（博士研究生6名、硕士研究生5名）。