猪肺炎支原体全基因组ORFs的克隆、表达及诊断标识的挖掘

由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，MHP）引起的猪气喘病是严重危害全球养猪业的重大疫病，被誉为影响养猪业经济效益的"隐性杀手"。特异、敏感、使用方便的诊断与检测技术是早期、及时发现疫病、防止疫病传播与扩散的关键,是有效控制与消灭动物传染病的前提。本项目拟针对猪肺炎支原体诊断技术中亟待解决的科学问题，在猪肺炎支原体、猪鼻支原体和絮状支原体基因组学和比较基因组学的基础上，通过大规模克隆和定点突变技术，对猪肺炎支原体168株编码的695个基因（ORFs）进行克隆，并在大肠杆菌系统进行高效表达和蛋白纯化。利用人工感染猪肺炎支原体的猪血清，结合ELISA和Western Blot方法，对表达纯化的蛋白进行多轮扫描和筛选，从猪肺炎支原体全基因组水平上挖掘具有潜在应用价值的诊断标识，为提高猪肺炎支原体诊断技术的特异性、敏感性以及早期检测奠定坚实的基础。

特异、敏感、使用方便的诊断与检测技术是早期、及时发现疫病、防止疫病传播与扩散的关键，也是有效控制与消灭动物传染病的前提。由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，MHP）引起的猪气喘病是严重危害全球养猪业的重大疫病，被誉为影响养猪业经济效益的“隐性杀手”。目前猪肺炎支原体的抗原和抗体诊断技术均不够敏感，难以达到早期、快速、准确诊断的要求。组学技术的快速发展与应用为挖掘新的诊断标识、发展更加特异、敏感的诊断技术提供了锲机。本项目开展了猪肺炎支原体基因组和比较基因组研究，克隆了猪肺炎支原体168株的全部编码基因(ORFs)并通过大肠杆菌系统进行表达，从猪肺炎支原体全基因组水平上挖掘具有潜在应用价值的诊断标识。取得主要研究结果如下：.测定并注释了猪鼻支原体、猪肺炎支原体亲本株和疫苗株的全基因组序列，开展了比较基因组学和功能基因组学研究，获得了一批可能与毒力和免疫相关的候选基因，完成了猪肺炎支原体168株全基因组504个ORFs的克隆，其中148个ORFs完成了基因的密码子改造，筛选并发现P46、MHP168_639、MHP168_348等蛋白能被猪肺炎支原体感染10天和28天的血清识别，制备了抗猪肺炎支原体P46、P97R1的单克隆抗体，建立了猪肺炎支原体抗体捕获ELISA和基于P36-P46-P97R1融合蛋白的间接ELISA检测方法2种。此外，还开展了猪肺炎支原体候选基因的免疫原性分析，发现P36-P46-P97R1三基因融合能显著提高免疫小鼠血清中的ELISA抗体水平，可以作为候选疫苗抗原，具有潜在的应用价值。.课题执行期内，在BMC Genomics、PLoS One上发表SCI论文2篇，建立了诊断方法2种，申请发明专利1项，培养博士研究生2名、硕士研究生3名。