猪δ冠状病毒辅助蛋白NS6调控内质网应激的分子机制研究

Virus infection often causes accumulation of unfolded proteins, triggering endoplasmic reticulum (ER) stress. Unfolded protein response (UPR) is a very important way to regulate the endoplasmic reticulum stress. The viruses can subtly regulate the UPR for their optimal replication and pathogenesis. As a newly emerging intestinal coronavirus in recent years and the sole detalcoronavirus that has been successfully isolated in cell culture system, porcine deltacoronavirus (PDCoV) can be served as a good model for researching deltacoronaviruses. Our previous studies demonstrated that PDCoV infection significantly triggers UPR, further conforming that virus-encoded accessory protein NS6 possesses strong ability of inducing UPR, but the molecular mechanism(s) utilized by NS6 protein is unclear. In this project, we plan to analyze the effect of NS6 protein on these signaling molecules and effector molecules in three UPR signaling pathways (PERK, IRE1, ATF6), identifying the key signaling pathways and the crucial functional domain(s) or possible amino acid residue(s) of NS6 protein responsible for its UPR induction property. Through using the established PDCoV reverse-genetic system, we will construct and rescue recombinant virus with deletion or mutation of NS6 protein, and analyze the biological characteristic and pathogenicity of these rescued PDCoV, revealing the effect of the ER stress regulated by NS6 protein on the viral replication and pathogenicity. Our research will lay the foundation for better understanding the mechanisms of PDCoV infection and pathogenesis.

病毒感染细胞后常引起大量未折叠蛋白积累，触发内质网应激，其中，未折叠蛋白反应（UPR）是调节内质网应激的重要途径。病毒可通过精细地调节UPR，使其达到最佳的复制以及致病性。猪δ冠状病毒（PDCoV）是近年来新发的肠道冠状病毒，也是目前唯一一个在体外成功培养的δ冠状病毒，是研究δ冠状病毒属的良好模型。我们的前期研究证实PDCoV感染明显诱发UPR，并进一步确定了病毒编码的辅助蛋白NS6具有很强的诱导UPR能力，但其调控UPR的机制尚不清楚。本项目拟分析NS6蛋白对3条UPR途径（PERK、IRE1、ATF6）信号分子以及效应分子的影响，确定关键信号通路以及NS6发挥作用的关键功能域或关键氨基酸位点；利用建立的反向遗传操作系统，构建NS6缺失或突变的重组病毒，分析不同重组病毒的生物学特性与致病性，从而揭示NS6调控内质网应激对病毒复制及其致病性的影响，为阐明PDCoV的感染与致病机制奠定基础。

许多研究表明病毒感染可以诱导内质网应激（ERS），激活未折叠蛋白反应（UPR），从而调控病毒自身复制。猪δ冠状病毒（PDCoV）是一种新出现的肠道致病性冠状病毒，具有跨种传播的潜力。前期研究发现PDCoV可诱导UPR，并且鉴定了PDCoV辅助蛋白NS6发挥重要作用。因此，本项目系统地研究了PDCoV感染条件下UPR信号通路的激活状态以及对病毒增殖的影响，探讨了NS6调控UPR的机制。此外，我们初步发现NS6可能参与病毒的侵入过程，因此，对PDCoV入侵猪回肠上皮细胞（IPI-2I）的分子细节进行了探索性研究，取得以下结果：（1）证实PDCoV感染激活了UPR 3条信号通路（PERK, IRE1和ATF6），确定了PERK信号激活抑制病毒增殖；ATF6信号激活促进病毒增殖；而IRE1信号激活对病毒增殖没有显著影响；（2）建立了一种快速构建PDCoV重组病毒的新方法，并且成功构建了外源表达EGFP/Nluc的重组PDCoV，用于抗PDCoV药物、细胞受体的筛选；（3）发现PDCoV NS6激活UPR的3条信号通路，初步确定了其跨膜区（aa 35-54）对其诱导UPR发挥重要作用，通过构建NS6缺失的PDCoV重组病毒，从病毒水平进一步证实了NS6在诱导内质网应激中的作用；（4）揭示了PDCoV依赖于网格蛋白和巨细胞饮途径，而不是小窝蛋白途径入侵IPI-2I细胞，并且依赖于动力蛋白和环境低pH值。这些研究结果为深入了解PDCoV的感染与致病，以及新型疫苗和药物开发奠定了基础。