拟南芥miR159调控离体干细胞中心重建的分子机制研究

So far, a set of genes regulating shoot regeneration have been found. However, the molecular mechanism is not clear yet. Our previous study showed that miR159 and MYB65 affected shoot regeneration, the mechanism of which was worth investigating. In this program, we will use Col-0, 35S::miR159, miR159ab, mMYB65 (miR159-resistant version of MYB65) and myb65 mutants to carry out the research as follows: Analyze the phenotype of the above plant lines and spatial-temporal expression patterns of miR159 and MYB65. Conform the stage that miR159 and MYB65 control during shoot regeneration and the regulation and localization relationship of them. Verify the exact time when miR159 and MYB65 control reconstitution of the shoot stem cell niche via spatial and temporal expression profile of WUS and CLV3 of the above plant lines. Screen the candidate target genes via RNA-seq and ChIP-seq. Validate the direct binding of MYB65 to target genes and confirm the genetic relationships of them via EMSA, ChIP, point mutant of promoters and plant crossing. Exploring and confirm the interacted proteins of MYB65 via yeast two hybrid, BiFC, GST-pull down and Co-IP. Validate the genetic relationships of them. The crucial aim of the project is to elucidate how miR159 regulates reconstitution of the shoot stem cell niche from in vitro cultures of Arabidopsis thaliana.

目前，一些调控离体苗再生基因已被发掘，其分子机理仍不清楚。我们发现miR159及靶基因MYB65控制拟南芥离体苗再生，其如何控制值得研究。本研究拟利用Col-0、35S::miR159、miR159ab、mMYB65（抗miR159剪切突变体）及myb65开展以下研究：分析上述材料表型及miR159及MYB65时空表达模式，明确其调控的再生时期及其表达定位关系；比较上述材料中WUS和CLV3时空表达模式差异，确定miR159及MYB65何时参与干细胞中心重建。利用RNA-seq和ChIP-seq，筛选候选靶基因。利用EMSA、ChIP、点突变靶基因启动子及植物杂交，验证MYB65与靶基因转录调控关系及遗传作用关系。利用酵母双杂技术发掘MYB65的互作蛋白，利用BiFC、GST-pull down、Co-IP等进一步验证，并确定其遗传学关系，揭示miR159调控离体干细胞中心重建的分子机制。

植物离体苗再生是植物发育研究的一个重要方面。植物体细胞在离体条件下可通过干细胞功能的获得和生长点干细胞中心的重建不断地再生植株，其中干细胞中心重建是植株再生的关键，是植物细胞工程的理论基础。目前，一些调控离体苗再生基因已被发掘，有关miRNA调控离体苗再生（尤其干细胞中心重建）的分子机制鲜有报道。拟南芥miR159功能的研究虽有一些进展，但有关miR159调控离体干细胞中心重建的作用尚未见报道。.本研究利用拟南芥Col-0、mir159ab突变体以及miR159靶基因的抗剪切系mMYB65为材料，开展了拟南芥miR159及其靶基因调控离体苗再生的分子机制研究，取得了以下研究成果：1）发现mir159ab及其靶基因的抗剪切系mMYB65的离体苗再生能力较野生型明显减弱，表明miR159促进离体苗再生，靶基因MYB65抑制离体苗再生；2）对miR159及其靶基因MYB65的表达分析发现，在离体苗再生过程中，miR159通过对靶基因MYB65的剪切抑制MYB65表达从而促进离体苗再生；3）与对照相比，干细胞关键基因WUS表达在mir159ab及mMYB65离体苗再生过程中明显减弱；MYB65通过直接结合WUS启动子而抑制WUS表达，从而抑制离体苗再生；4）MYB65通过直接促进生长素响应蛋白IAA17表达来抑制离体苗再生。5）发现MYB65 通过与ARR5互作来调控离体苗再生。综上，拟南芥miR159及其靶基因MYB65通过直接调控干细胞关键基因WUS及生长素响应因子基因IAA17表达，通过与细胞分裂素响应因子ARR5互作，进而调控离体苗再生，为我们更加深入的理解miRNA与生长素和细胞分裂素信号通路与WUS紧密联系共同调控离体苗再生提供了一个新的思路。.