DRN调控拟南芥茎顶端干细胞稳态维持的分子机制

In post-embryo development, up-ground tissues origin from the cell division and differentiation of shoot apical stem cells. The maintainence of stem-cell homeostasis plays an essential role in the process. Auxin regulates the transcription of CLV3 mediated by DRN, which is required to define the limits of stem cells. However, how DRN activate the transcription of CLV3 remains elusive. This project intends to explore the cofactors interacted with DRN, which will help us to elaborate the mechanism of DRN activate CLV3 transcription. In addition, some results show that overexpression of DRN in stem cell cause the explosive stem-cell division, which indicates a downstream pathway of DRN independent of CLV3 in control of stem-cell homeostasis. RNA-sequencing will be employed to explore the downstream genes of DRN and its cofactors, which will illuminate how auxin regulates stem-cell homeostasis mediated by DRN.

拟南芥胚后发育的地上器官均来自于茎顶端干细胞的分裂和分化，干细胞稳态的维持在此过程中扮演着重要的角色。我们已发表的工作表明，在干细胞中表达的转录因子DRN介导了生长素信号对植物干细胞稳态的调控。DRN可以直接激活干细胞标记基因CLV3的转录从而调控干细胞的稳态，但此激活转录作用并不依赖DRN的DNA结合活性，其激活CLV3转录的分子机制尚不清楚。此外，我们的前期未发表的工作还发现在clv3突变体背景下过表达DRN能够造成干细胞的过度增殖，表明DRN存在一个独立于CLV3的信号通路来参与干细胞稳态的调控。本项目拟通过寻找与DRN互作的蛋白解析DRN激活CLV3转录的分子机制，并利用RNA-sequencing来获得干细胞中DRN及其互作蛋白直接调控的下游基因，阐述DRN介导的生长素信号调控植物干细胞维持的分子机制。

拟南芥茎端干细胞位于茎顶端分生组织的中央。WUSCHEL (WUS)基因表达在茎端干细胞下方的组织中心区域，维持干细胞的属性。同时，WUS蛋白也能进入干细胞中并激活茎端干细胞的marker基因CLAVATA3 (CLV3) 的表达，而CLV3基因作为多肽信号具有抑制WUS基因表达的功能，此负反馈循环维持了干细胞数目的稳定。根据已发表的研究，转录因子DORNROSCHEN（DRN）也能够在干细胞中激活CLV3基因的表达，但是此种激活调控不依赖于DRN蛋白的DNA的结合功能。因此，我们所要探究的科学问题是DRN蛋白激活CLV3基因转录的分子机制。.我们基于相关文献调研和酵母双杂交筛库实验获取到两个可能与DRN蛋白互作的候选蛋白—WUS蛋白和染色质重塑关键蛋白BRAHMA(BRM)。.主要研究结果和结论如下：.（1）DRN蛋白与WUS蛋白、BRM蛋白互作.我们开展了酵母双杂交、pull-down、BiFC、co-IP实验，结果均显示WUS蛋白与DRN蛋白之间存在互作，BRM蛋白与DRN蛋白之间也存在互作。酵母三杂交和pull-down实验证明了WUS蛋白可以形成同源二聚体，而DRN蛋白的加入能够竞争破坏WUS蛋白的同源二聚体，形成DRN-WUS异源二聚体。.（2）DRN蛋白、WUS蛋白共同参与对CLV3基因的表达调控.我们构建了DRN-GR/WT和DRN-GR/wus-7两种转基因植株。结果显示，在野生型背景下DRN-GR能够经DEX诱导并激活CLV3基因的转录，但此种激活效应不会出现在DRN-GR/wus-7植株中。这说明DRN蛋白激活CLV3的转录依赖WUS基因。.（3）BRM调控CLV3的表达依赖DRN基因. 我们构建了野生型背景下乙醇可诱导的干细胞特异的BRM敲低株系CLV3::inducible amiBRM/WT，当乙醇诱导后BRM在干细胞中表达量下调，继而CLV3的表达量下调。但是在drn-1突变体背景下，CLV3::inducible amiBRM/drn-1植株的CLV3的表达量不受乙醇诱导后BRM表达量下调的影响。这说明BRM调控CLV3的表达依赖DRN基因。.综上，DRN蛋白可以分别与WUS蛋白、BRM蛋白相互作用，三者形成蛋白复合体，继而调控CLV3的转录，最终调节茎端干细胞的稳态。