拟南芥生长素响应因子ARF10调控离体苗再生的分子机制研究

So far, a set of genes regulating the shoot regeneration have been found. However, the molecular mechanism is not clear yet. Our study showed that miR160 is able to control the shoot regeneration through down-regulating ARF10, the mechanism of which is worth investigating. In this program, we will use Col-0, ARF10-OX, mARF10（miR160-resistant version of ARF10）and arf10 mutants to carry out the research as follows: 1.Selecting the candidate genes via analyzing the expression of genes involved in WUS and phytohormone signaling pathway; Identifying the key genes through analyzing mutants regeneration abilities and the transcription level of WUS; Conforming the genetic relationships between key genes and ARF10 by crossing. 2. Finding out target genes, transcription levels are different among the materials mentioned above, directly bound by ARF10 through microarray and ChIP-seq; Preliminarily conforming target genes by analyzing the regeneration abilities of their mutants and the transcription levels of regeneration related genes; Verifying ARF10 being able to binding the target genes via EMSA and ChIP; Conforming the genetic relationships between target genes and ARF10 by crossing; Revealing the regulation network in which ARF10 and its target genes are probably involved. The crucial aim of the project is to elucidate how ARF10 regulates the in vitro shoot regeneration in Arabidopsis.

目前，一些调控离体苗再生的基因已被发掘，其分子机理仍不清楚。我们发现ARF10在miR160负调控下控制拟南芥离体苗再生，其如何控制值得研究。本研究拟利用Col-0、35S::ARF10、mARF10（抗miR160剪切突变体）及arf10开展以下研究：1、分析WUS通路（包括激素）相关基因表达变化，筛选候选基因；分析候选基因突变体再生能力及WUS表达变化，初步确定目标基因；利用杂交互补，确定ARF10与目标基因的遗传学关系；2、利用基因芯片及ChIP-seq，筛选差异表达且与ARF10结合的候选靶基因；分析候选靶基因突变体再生能力及离体苗再生相关基因表达变化，初步确定目标靶基因；用EMSA、ChIP等，验证ARF10对目标靶基因的直接调控作用；利用杂交互补，确定ARF10与靶基因的遗传学关系；解析ARF10与靶基因可能参与的调控网络，最终揭示ARF10调控拟南芥离体苗再生的分子机制。

植物离体器官再生是植物发育研究的一个重要方面，是指已分化的根、子叶、下胚轴等外植体在合适的激素配比下诱导形成离体苗、根等器官的过程。目前，植物离体器官再生的过程已经得到较好的研究，亦挖掘了一些参与离体器官再生的基因，但有关离体器官再生的调控机理仍不清楚。植物激素是影响植物离体器官再生的关键因素，目前认为，生长素和细胞分裂素可能通过激活特定的激素信号转导途径从而启动了离体苗的生长发育过程。二者的互作诱导了离体愈伤组织形成、干细胞组织中心和生长点的建立。一些生长素和细胞分裂素信号转导相关基因调控愈伤组织形成和离体苗再生已被证实，但它们的相互作用关系及其调控机制尚有待揭示。.本研究利用拟南芥Col-0、mARF10（抗miR160剪切突变体）及arf10（敲除系）开展了生长素响应因子ARF10调控离体苗再生的分子机制研究，取得了以下研究成果：1）表型分析发现，mARF10离体苗再生及离体生长点重建能力较Col-0增强，而arf10较Col-0减弱，表明ARF10通过促进离体生长点重建促进离体苗再生；2）利用RNA-seq及实时定量等方法发现，ARF10抑制ARR15的表达，而促进LBD33的表达；3）利用ChIP及EMSA等方法发现，ARF10通过结合ARR15的启动子抑制其表达，通过结合LBD16的启动子促进其表达；4）通过植物杂交等遗传分析发现，ARF10通过抑制靶基因ARR15的表达，促进靶基因LBD33的表达，促进离体苗再生；5）发现ARF10对离体苗形成的影响起始于愈伤组织，ARF10通过直接抑制ARR15表达来促进愈伤组织的起始和形成，ARF10-ARR15是离体苗再生中生长素和细胞分裂素信号的分子纽带，其通过影响拟南芥外植体中生长素和细胞分裂素的响应来调控拟南芥愈伤组织形成及离体苗再生。研究结果从组织水平、分子水平、生化水平及遗传水平上全面地揭示了ARF10调控拟南芥离体苗再生的分子机制，从而为更深入理解生长素及细胞分裂素如何调控离体苗再生提供了思路。