组蛋白修饰对内毒素血症炎症介质释放的特异性调控

我们前期的研究工作发现，小鼠内毒素休克后其肝组织多个组蛋白家族成员的等电点发生了显著变化（酸化），提示LPS刺激后组蛋白发生了翻译后修饰改变；同时，在对鉴定的内毒素休克前后差异蛋白质进行功能信息的分析中发现了一些参与甲基化和乙酰化的蛋白质。为了进一步查明内毒素刺激后组蛋白的修饰特征，找出特异性调控炎症介质释放的组蛋白修饰位点，验证前期发现的参与了乙酰化和甲基化反应的蛋白质及其在内毒素炎症反应组蛋白修饰中的作用，本研究利用染色质免疫沉淀技术(ChIP)、实时定量PCR、Western blot和RNAi等分子生物学手段探索与基因特异性调控有关的H3, H4组蛋白的乙酰化和甲基化修饰特征；验证已发现的修饰酶对组蛋白的修饰机制。本项目的研究结果对于丰富组蛋白修饰的机制,进一步阐明炎症反应及内毒素休克的发生机理，探索更合理有效的抗炎介质都具有重要的理论指导意义和实践价值。

越来越多的研究表明，组蛋白修饰在基因特异性转录调控中发挥了至关重要的作用。我们前期的研究工作发现，小鼠内毒素休克后其肝组织多个组蛋白家族成员的等电点发生了显著变化（酸化），提示LPS 刺激后组蛋白发生了翻译后修饰改变；同时，在对鉴定的内毒素休克前后差异蛋白质进行功能信息的分析中发现了一些参与甲基化和乙酰化的蛋白质。为了进一步查明内毒素刺激后组蛋白的修饰特征，验证前期发现的乙酰化和甲基化修饰酶及其在内毒素炎症反应中的作用，本研究利用染色质免疫沉淀技术(ChIP)、实时定量PCR、Western blot 和RNAi 等分子生物学手段探索了与基因特异性调控有关的组蛋白3（H3），H4 组蛋白的乙酰化和甲基化修饰特征；探讨了已发现的修饰酶SETD4（SET domain containing 4）在内毒素休克中的作用。结果发现，①在内毒素血症中，H3K4me2/3、H3K9me2/3、H3K27me2、H3K36me2、H3K79me2、H4乙酰化发生了改变，且随着时间的变化而动态变化；H3K4me2和H3K9me2/3在LPS刺激巨噬细胞后增强最明显。②LPS刺激0.5 h后H3K4me2在IL-6和TNFα基因启动子处结合增强；进一步用组蛋白甲基转移酶抑制剂MTA[5’-deoxy-5’-(methylthio)adenosine]抑制H3K4二甲基化后抑制IL-6和TNFα的基因转录，结果提示H3K4me2可能参与了炎症介质的转录调控。③SETD4属于SET家族蛋白中的一种，目前对其鲜见报道。本研究发现，正常情况下SETD4蛋白分布于胞浆及胞核中，主要位于胞浆；LPS刺激后SETD4入核，同时还伴随着蛋白表达及其mRNA水平的增加，提示SETD4可能参与了内毒素血症的发生与发展。④下调或上调巨噬细胞SETD4表达，LPS刺激所致的炎症介质如IL-6和TNFα释放减少或者增加。⑤利用SETD4敲基因小鼠复制内毒素休克模型，结果发现与野生型小鼠相比，SETD4基因敲除小鼠受到LPS攻击时，血清中细胞因子如IL-6和TNFα的释放明显减少。上述结果提示SETD4通过调控炎性细胞因子的释放参与了内毒素血症的发生与发展。本项目的研究结果对于丰富组蛋白修饰的机制，进一步阐明炎症反应及内毒素休克的发生机理，探索更合理有效的抗炎措施都具有重要的理论指导意义和实践价值。