转录因子对丹酚酸类化合物生物合成调控研究

前期工作中我们获得两个可能参与苯丙烷类化合物代谢的转录因子，TF1和TF2。.本研究拟进一步探讨这两个转录因子与丹酚酸类化合物生物合成的关系。.拟将两个转录因子分别构建到植物表达载体中，通过农杆菌介导的遗传转化方法，获得转TF1和TF2基因的丹参毛状根。荧光定量PCR及Northern杂交分析转基因丹参毛状根中PAL、TAT、4CL、HPPR、RAS等基因的转录表达水平，探讨这两个转录因子对这些基因的转录调控作用；同时提取丹酚酸类化合物，HPLC定量分析丹酚酸B及迷迭香酸含量，探讨转录因子对丹酚酸类化合物生物合成的调控作用；并进一步筛选丹酚酸B高含量的转基因丹参毛状根，为工业化生产丹酚酸B提供种质材料来源。

丹参及其制剂广泛应用于心脑血管疾病的治疗。其主要有效成分为水溶性丹酚酸类化合物和脂溶性丹参酮类化合物。.本项目应用转录因子TF1和TF2进行丹参的遗传转化，共获得56株转基因丹参毛状根：其中转TF1 23株，转TF2子17株，同时转TF1和TF2 16株。阴性对照 16株。对获得的毛状根中有效成分进行HPLC定量测定。丹酚酸B和丹参酮IIA的平均含量分别为：转TF1：丹酚酸B，25.45±20.17mg/g，丹参酮IIA，1.23±0.40 mg/g；转TF2：丹酚酸B，68.47±22.93mg/g，丹参酮IIA，0.50±0.21mg/g；同时转TF1和TF2：丹酚酸B，27.35±15.37mg/g，丹参酮IIA，0.79±0.29 mg/g；对照：丹酚酸B，62.85±13.40mg/g，丹参酮IIA，0.53±0.14 mg/g。以上结果说明，转录因子TF1抑制丹酚酸B的生物合成，但明显促进丹参酮IIA的积累，丹参酮IIA的平均含量是对照的2.4倍；转录因子TF2对丹酚酸B和丹参酮IIA的调控作用不明显。.采用荧光定量PCR对TF1的表达水平进行绝对定量分析， SPSS19.0软件对TF1表达水平与丹酚酸和丹参酮含量进行相关性分析，结果显示：转录因子TF1与丹参酮IIA的相关系数为0.731，与丹酚酸B的相关系数为-0.689。丹参酮IIA与丹酚酸B相关系数为-0.848。说明，丹参酮IIA含量的提高、丹酚酸B含量的降低与TF1密切相关，且丹参酮IIA和丹酚酸B含量存在明显负相关性。.对丹酚酸类化合物生物合成途径8个基因和丹参酮生物合成途径22个基因进行表达分析，结果显示：丹酚酸类化合物生物合成途径中，TF1上调了C4H和RAS基因的转录表达，TF2上调了PAL2和C4H基因的表达；丹参酮类代谢途径中，TF1促进了所有22个基因的转录表达，表达水平为对照的1.6-26.5倍；TF2对HMGR1、HMGR、HMGR3、MK、MDC、DXS1、MCT、MDS、HDS、CPS5表现出1.5-9.0不等的上调作用。.以上结果表明，转录因子TF1能促进丹参酮的生物合成，抑制丹酚酸类化合物生物合成。也预示着，丹酚酸类化合物和丹参酮的生物合成可能存在关联性。.该研究结果对阐明丹参中有效成分的积累规律及应用生物技术提高丹参中有效成分含量具有重要意义。