基于合成生物学的丹酚酸类化合物生物合成研究

Salvianolic acids are the major water-soluble bioactive ingredient in Danshen Radix. Salvianolic acids mainly salvianolic acid B (SAB) have been isolated and prepared as Salvianolate (80% is magnesium Sal B) Injection for clinical usage to cure coronary heart disease and angina. At present, these compounds are derived from danshen roots, in which salvianolic acids are believed to be synthesized through the phenylpropanoid metabolism and rosmarinic acid is the first stable and also a valuable medicinal compound..In this proposal, we want to apply the synthetic biology and use Saccharomyces cerevisiae as host cell to create the mimic RA biosynthesis pathway. To do that, the RA pathway has been re-designed by using TAL to replace PAL and C4H with tyrosine as the initial substrate. Computational-based homology modeling and molecular docking will be employed to predict the appropriate candidate genes. Modular strategy will be adopted to optimize the metabolic flux from the substrate (tyrosine) to the committed product (rosmarinic acid, RA). Besides, the biosynthesis pathway from RA to SAB will be investigated and constructed with the aim to produce SAB in the engineered yeast. Then, the tyrosine to RA pathway will be combined with this RA to SAB construct to create yeast strain harboring the whole pathway from tyrosine to salvianolic acid B. Fermentation optimization will also be performed to achieve high-efficient yields of RA and SAB. .The research in this proposal provides a new way for producing valuable medicinal compounds.

丹酚酸类化合物是中药丹参的主要有效成分之一。以丹酚酸B（SAB）为主要成分制成的现代中药丹参多酚酸盐注射液在治疗心脑血管疾病方面效果显著，临床上应用广泛。目前，丹酚酸B主要从中药丹参中提取。.植物中丹酚酸类化合物由苯丙烷类代谢途径产生，迷迭香酸（RA）是其生物合成途径中第一个结构稳定且具有显著药理活性的化合物。.本项目采用合成生物学思路，以酿酒酵母为底盘细胞，RA为第一目标产物，对植物中RA途径进行设计并重建：以TAL替代PAL和C4H催化的两步反应，借助计算机同源建模与分子对接技术选择候选基因，应用模块策略将RA途径分模块组合优化，将最佳模块构建成基因整合型表达盒，整合入酵母基因组，实现RA途径（Tyr-RA）在酵母中重建；同时，以SAB为第二目标产物，探索并构建由RA到SAB的异源合成途径（RA-SAB）；并进行发酵工艺优化，提高产物得率。.项目成果将为重要药用化合物提供新的生产策略。

丹酚酸类化合物是中药丹参的主要有效成分之一。以丹酚酸B为主要成分制成的现代中药丹参多酚酸盐注射液在治疗心脑血管疾病方面效果显著，临床应用广泛。目前，丹酚酸B主要从中药丹参中提取，迷迭香酸是其生物合成途径中一个重要的活性分子，也具有显著的抗炎、抗氧化等生物活性。酿酒酵母是环境友好且在人类日常生活中广泛使用的绿色安全微生物。以酿酒酵母为底盘细胞的合成生物学为重要价值天然产物的生物合成提供了新思路。.本项目基于合成生物学原理，通过对迷迭香酸生物合成途径关键基因的选择，在酿酒酵母底盘细胞中重建了迷迭香酸生物合成途径，并通过基因表达模块与启动子元件的组合优化，得到了两株能稳定合成迷迭香酸和丹酚酸B的工程酿酒酵母株系YW-M9和YW-M10。在不添加任何底物情况下，用液体营养缺陷型培养基SD-Trp-Leμ-Ura发酵48小时，两个株系发酵液中得到迷迭香酸，其中YW-M10中RA含量最高，为6μg/L；发酵72小时，YW-M9和YW-M10都合成了丹酚酸B，含量分别为34μg/L和30μg/L。.此外，我们在工程酿酒酵母发酵液中也检测到4-羟基苯丙酮酸、4-羟基苯乳酸、4-羟基苯丙酸（p-Hydroxybenzene propanoic acid，HPPA）等中间产物或副产物，这可能是影响终产物含量的重要因素，为后续进一步提高目标产物丹酚酸B的产量提供了依据。特别地，我们还发现，酿酒酵母底盘细胞与外源迷迭香酸生物合成途径协同作用合成了丹酚酸B，这一发现为尚未明了的丹酚酸B的生物合成机制探索提供了新的思路。.项目成果为重要药用资源丹酚酸B的工业化生产奠定了基础。同时，也为其它复杂苯丙烷类药用天然产物如木脂素clemastanin B等的细胞工厂构建提供了参考，为中药资源可持续利用提供新的途径。